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关于TOP10感受态细胞筛选阳性克隆 已有7人参与
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最近在做重组质粒阳性克隆筛选，但是感受态细胞转化后涂平板，平板上都长成菌苔，一大片都是大肠杆菌，已经证明平板以及所使用的Ampcillin都可以正常使用，请各位虫友帮忙分析一下原因所在。 我的感受态细胞制备流程是这样的: （1）从无Amp的LB平板上挑取单克隆菌体，打入3ml无Amp的LB液体培养液中，37℃，220rpm，振摇过夜； （2）取过夜培养菌液1ml，加入100ml无Amp的LB中，220rpm，37℃培养约1h45min，分光光度计测OD600，OD600为0.4~0.5（实际测的时候已经达到0.650）； （3）（此步开始在冰上操作）用圆底50ml Tube收集菌液，5000rpm，4℃，离心5min，弃上清，每40~50ml培液加5ml Sol. A，轻轻混匀，5000rpm，继续离心5min； （4）弃上清，加5ml Sol B，轻轻混匀置于冰上30min; （5）5000rpm，离心5min后弃上清，用15%甘油+85%SOL B混合液悬浮； （6）每管200μl分装，保存于-80℃ 热转化感受态细胞： （1）从-80℃取出刚制备的TOP10感受态细胞200μl，置于冰上慢慢融化（约5min）； （3）取10μl连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min； （4）42℃金属浴热激90s，放于冰上冰冻2~3min(此过程中可以将冰浴移至超净台中，进行下一步准备)； （5）加800μl无Amp的LB培养液，37℃，150rpm，摇床培养45min； （6）取200μl菌液，加入新的1.5mlEP管中，再加入200μl无Amp的LB培养基稀释，轻轻吹打均匀后，全部加到Amp-LB平板上，涂布均匀。37℃恒温培养箱培养12h。 平板在培养箱中37℃过夜培养后，平板上长满了菌落，形成菌苔，按理说转化效率不应该这么高的，我的连接产物目的质粒的浓度不到5ng/μl，所使用的Amp-LB平板没有问题（同实验室的师姐用的同一批倒的平板来做转化，能成功），感受态细胞是当天上午做好，晚上就用于转化的，现在不知道问题出在哪里，请虫友们帮忙分析分析，多谢了！ |
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huizhang523
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