| 查看: 3027 | 回复: 9 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
关于TOP10感受态细胞筛选阳性克隆 已有7人参与
|
|||
|
最近在做重组质粒阳性克隆筛选，但是感受态细胞转化后涂平板，平板上都长成菌苔，一大片都是大肠杆菌，已经证明平板以及所使用的Ampcillin都可以正常使用，请各位虫友帮忙分析一下原因所在。 我的感受态细胞制备流程是这样的: （1）从无Amp的LB平板上挑取单克隆菌体，打入3ml无Amp的LB液体培养液中，37℃，220rpm，振摇过夜； （2）取过夜培养菌液1ml，加入100ml无Amp的LB中，220rpm，37℃培养约1h45min，分光光度计测OD600，OD600为0.4~0.5（实际测的时候已经达到0.650）； （3）（此步开始在冰上操作）用圆底50ml Tube收集菌液，5000rpm，4℃，离心5min，弃上清，每40~50ml培液加5ml Sol. A，轻轻混匀，5000rpm，继续离心5min； （4）弃上清，加5ml Sol B，轻轻混匀置于冰上30min; （5）5000rpm，离心5min后弃上清，用15%甘油+85%SOL B混合液悬浮； （6）每管200μl分装，保存于-80℃ 热转化感受态细胞： （1）从-80℃取出刚制备的TOP10感受态细胞200μl，置于冰上慢慢融化（约5min）； （3）取10μl连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min； （4）42℃金属浴热激90s，放于冰上冰冻2~3min(此过程中可以将冰浴移至超净台中，进行下一步准备)； （5）加800μl无Amp的LB培养液，37℃，150rpm，摇床培养45min； （6）取200μl菌液，加入新的1.5mlEP管中，再加入200μl无Amp的LB培养基稀释，轻轻吹打均匀后，全部加到Amp-LB平板上，涂布均匀。37℃恒温培养箱培养12h。 平板在培养箱中37℃过夜培养后，平板上长满了菌落，形成菌苔，按理说转化效率不应该这么高的，我的连接产物目的质粒的浓度不到5ng/μl，所使用的Amp-LB平板没有问题（同实验室的师姐用的同一批倒的平板来做转化，能成功），感受态细胞是当天上午做好，晚上就用于转化的，现在不知道问题出在哪里，请虫友们帮忙分析分析，多谢了！ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有200人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 构建基因文库的方法筛选到阳性克隆，克隆中插入的基因长为8000bp，如何找到目的基因？
已经有17人回复
- 克隆时卡那筛选菌落
已经有7人回复
- 只涂感受态细胞的平板也长出了菌落？
已经有10人回复
- PCR片段连接载体，转化不出阳性克隆，求解?
已经有14人回复
- 做TA克隆的时候，用什么做阴性对照
已经有14人回复
- 感受态转化及阳性克隆出现问题
已经有15人回复
- 有关T载体以及蓝白筛选的3个问题
已经有9人回复
- 关于TA克隆蓝白斑筛选
已经有12人回复
- 令我崩溃的TA克隆，老是连不上
已经有33人回复
- TA克隆，假阳性？假阴性？
已经有16人回复
- 求助分子克隆问题——挑不出阳性克隆！
已经有14人回复
- 第一次做蓝白斑筛选，培养12h后无斑
已经有9人回复
- T-A克隆一直做不出来
已经有28人回复
- 基因克隆过程中质粒、感受态细胞对氨苄的抗性
已经有9人回复
- 转化子太多假阳性，怎么办呀？
已经有11人回复
- Fosmid文库大片段的阳性克隆子筛选和测序问题
已经有18人回复
- 阳性克隆的筛选问题
已经有15人回复
- 大肠杆菌DH5α感受态制备
已经有21人回复
- 虫子们有谁做过TA克隆呀？额想知道TA克隆的具体的实验步骤
已经有25人回复
- 求助 双酶切验证阳性克隆的问题
已经有12人回复
- 亲们~谁做过酿酒酵母的转化，怎么筛选阳性克隆呢？
已经有5人回复
- 【专题】分子克隆实验专题--（五）感受态细胞的选择与使用
已经有15人回复
- 【求助/交流】克隆Amp/Kan选择以及蓝白筛选
已经有10人回复
- 【求助/交流】大家做TA克隆、蓝白斑筛选用什么样的感受态细胞？
已经有20人回复
9楼2015-04-10 16:25:18
jiqinger
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 88 (初中生)
- 金币: 5179.6
- 红花: 16
- 帖子: 745
- 在线: 165.7小时
- 虫号: 1679784
- 注册: 2012-03-10
- 性别: GG
- 专业: 化学环境污染与健康
2楼2015-04-09 12:54:35
浅语8905
新虫 (小有名气)
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 436.1
- 帖子: 125
- 在线: 34小时
- 虫号: 3438071
- 注册: 2014-09-24
- 性别: MM
- 专业: 微生物遗传育种学
3楼2015-04-09 14:32:30
starseacow
专家顾问 (职业作家)
-
专家经验: +426 - MolEPI: 3
- 应助: 1217 (讲师)
- 金币: 9097.3
- 散金: 16445
- 红花: 226
- 帖子: 4669
- 在线: 2320.2小时
- 虫号: 1136974
- 注册: 2010-11-02
- 性别: GG
- 专业: 植物生理与生化
- 管辖: 动植物
4楼2015-04-09 14:39:33
5