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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » western内参的转膜问题
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nxyangbei

新虫 (初入文坛)

[求助] western内参的转膜问题 已有2人参与

western新手菜鸟一枚，做170kda蛋白，β-actin做内参，转膜200mA,2h,目的蛋白经过后面步骤处理后有条带，但是内参做了很多遍什么都没有。因为一抗二抗都是别人用过的，所以怀疑是转膜问题。请问43Kda蛋白200ma,2h，是转过了嘛？NC膜0.45um.
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1楼 2015-03-29 17:14:05
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nxyangbei

新虫 (初入文坛)
补充：胶考染后能看到内参条带
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2楼2015-03-29 17:16:19
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lidong.0107

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是你转的时间有点长，不论是湿转还是干转都不需要这么久
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3楼2015-03-30 09:46:43
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nxyangbei

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lidong.0107 at 2015-03-30 09:46:43
可能是你转的时间有点长，不论是湿转还是干转都不需要这么久

谢谢，那我切开分开转试一下。可以一个夹子放目的蛋白的胶，一个夹子放内参的胶，转到一定时间停下来吧内参的那个三明治拿出来然后再继续转目的蛋白吗？转膜中间可以停吗？
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4楼2015-03-30 13:29:33
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海绵船长

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的膜孔径太大，换0.22的膜来做，就没问题了，时间也是合理的

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5楼2015-03-30 14:44:00
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海绵船长

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by nxyangbei at 2015-03-30 13:29:33
谢谢，那我切开分开转试一下。可以一个夹子放目的蛋白的胶，一个夹子放内参的胶，转到一定时间停下来吧内参的那个三明治拿出来然后再继续转目的蛋白吗？转膜中间可以停吗？...

转膜最好中间不要停。

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6楼2015-03-30 14:44:46
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lidong.0107

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by nxyangbei at 2015-03-30 13:29:33
谢谢，那我切开分开转试一下。可以一个夹子放目的蛋白的胶，一个夹子放内参的胶，转到一定时间停下来吧内参的那个三明治拿出来然后再继续转目的蛋白吗？转膜中间可以停吗？...

中间停一下我做过，没有问题，你得目的蛋白是多大的？因为.45的膜有点大，注意时间的控制
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7楼2015-03-30 15:54:22
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nxyangbei

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 海绵船长 at 2015-03-30 14:44:46
转膜最好中间不要停。
...

目的蛋白170Kda
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8楼2015-04-01 14:53:42
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nxyangbei

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lidong.0107 at 2015-03-30 15:54:22
中间停一下我做过，没有问题，你得目的蛋白是多大的？因为.45的膜有点大，注意时间的控制...

我的目的蛋白有170Kda
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9楼2015-04-01 14:56:20
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nxyangbei

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 海绵船长 at 2015-03-30 14:44:46
转膜最好中间不要停。
...

谢谢啦
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10楼2015-04-01 14:58:10
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