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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 急急急！！western 半干转膜屡次失败，求大神救命！
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janelnnq

铁虫 (初入文坛)

[求助] 急急急！！western 半干转膜屡次失败，求大神救命！已有5人参与

最近做了4次western转膜，都失败了，求大神帮帮我吧~~快崩溃了~
仪器：biorad semi-dry cell
目的蛋白：100KD左右，用的预染（30-230KD）marker，其中有一条80KD的红色marker。
问题：用的biorad的厚滤纸，师姐说中间还要加层薄滤纸，所以最中的三明治是厚海绵-薄滤纸-0.44 PVDF膜-薄滤纸-厚海绵，半干条件下15V，30min，看到大部分的条带都转到厚海绵上了，薄滤纸上很干净，膜上看不清条带，丽春红预染后看不见有什么条带。
后来又跑了一块胶，15V,20min，结果发现红色条带以上的都还在胶上，底部的厚海绵上仍旧可以看到模糊的marker条带。请问大神这是转过了，还是还没转上呢？前后就差10min，半干转的这么快吗？我们实验室师姐跑的40KD，同样仪器说是用了40min,为什么我这蛋白比较大反而转的比较快呢？实在想不明白~~
本人菜鸟，许多条件都太熟，什么都得自己摸，求帮助呀~~
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1楼2014-01-11 18:57:56
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回帖置顶 ( 共有1个 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2014-01-27 10:04:09
很奇怪你会把marker转过。通常0.45的PVDF大蛋白很难通过的。半干转移只有三明治处有电流通过，所以体系的电压和电流都比较小。我通常都是做稳流，电流根据三明治的面积计算。你说的15v的电流大约是多少（应该是开始时大，慢慢变小）。因为体系里的buffer少，为了保证体系在转移过程中不干，通常需要在三明治的上下各放2-4层转移buffer浸湿的厚滤纸，薄滤纸没必要。半干转移的时间要看你设置的电压和电流。也就是单位面积上的功率。
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6楼2014-01-12 02:44:06
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普通回帖

janelnnq

铁虫 (初入文坛)
三明治膜上层忘记打上胶了~
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2楼2014-01-11 18:59:08
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yyshpy007

禁虫 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2014-01-12 07:49:13
本帖内容被屏蔽
3楼2014-01-11 19:55:10
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janelnnq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yyshpy007 at 2014-01-11 19:55:10
100kd蛋白转不到半小时，时间太短了吧，电压那么小，你查查大家的经验电压和时间吧，我们都常用湿转，要120V 2小时呢

是，我也觉得很奇怪，但是半干确实要求电压比较小~大家都是wet做的比较多，貌似semi-dry的经验帖不多~
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4楼2014-01-11 22:32:08
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yyshpy007

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★
silicare: 金币+3, 谢谢参与 2014-01-27 10:04:37
本帖内容被屏蔽
5楼2014-01-11 23:47:22
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janelnnq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-12 02:44:06
很奇怪你会把marker转过。通常0.45的PVDF大蛋白很难通过的。半干转移只有三明治处有电流通过，所以体系的电压和电流都比较小。我通常都是做稳流，电流根据三明治的面积计算。你说的15v的电流大约是多少（应该是开始 ...

谢谢，我做了几次还是不行，不知道为什么每次都是预染的marker跑到滤纸上，刚开始觉得是不是预染的marker染料脱掉了，但师姐说不太可能，再不行就转成wet的～

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2014-01-21 08:59:52
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janelnnq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by janelnnq at 2014-01-21 08:59:52
谢谢，我做了几次还是不行，不知道为什么每次都是预染的marker跑到滤纸上，刚开始觉得是不是预染的marker染料脱掉了，但师姐说不太可能，再不行就转成wet的～
...

这个功率有计算方法吗？大概是什么样的合适呢～～我查的时候没看到有说这方面的，请楼主指教～～

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2014-01-21 09:01:52
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare: 金币+2, 在理 2014-01-27 10:04:26
别求快
该湿转的还是湿转
那点时间找点啥事都好干
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9楼2014-01-21 10:26:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by janelnnq at 2014-01-21 08:59:52
谢谢，我做了几次还是不行，不知道为什么每次都是预染的marker跑到滤纸上，刚开始觉得是不是预染的marker染料脱掉了，但师姐说不太可能，再不行就转成wet的～
...

是不是预染marker的问题？你有没有对转好的膜继续做western看结果？
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10楼2014-01-22 08:01:34
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