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janelnnq

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 急急急！！western 半干转膜屡次失败，求大神救命！已有5人参与

最近做了4次western转膜，都失败了，求大神帮帮我吧~~快崩溃了~
仪器：biorad semi-dry cell
目的蛋白：100KD左右，用的预染（30-230KD）marker，其中有一条80KD的红色marker。
问题：用的biorad的厚滤纸，师姐说中间还要加层薄滤纸，所以最中的三明治是厚海绵-薄滤纸-0.44 PVDF膜-薄滤纸-厚海绵，半干条件下15V，30min，看到大部分的条带都转到厚海绵上了，薄滤纸上很干净，膜上看不清条带，丽春红预染后看不见有什么条带。
后来又跑了一块胶，15V,20min，结果发现红色条带以上的都还在胶上，底部的厚海绵上仍旧可以看到模糊的marker条带。请问大神这是转过了，还是还没转上呢？前后就差10min，半干转的这么快吗？我们实验室师姐跑的40KD，同样仪器说是用了40min,为什么我这蛋白比较大反而转的比较快呢？实在想不明白~~
本人菜鸟，许多条件都太熟，什么都得自己摸，求帮助呀

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1楼2014-01-11 18:57:56

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2014-01-27 10:04:09

很奇怪你会把marker转过。通常0.45的PVDF大蛋白很难通过的。半干转移只有三明治处有电流通过，所以体系的电压和电流都比较小。我通常都是做稳流，电流根据三明治的面积计算。你说的15v的电流大约是多少（应该是开始时大，慢慢变小）。因为体系里的buffer少，为了保证体系在转移过程中不干，通常需要在三明治的上下各放2-4层转移buffer浸湿的厚滤纸，薄滤纸没必要。半干转移的时间要看你设置的电压和电流。也就是单位面积上的功率。