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钟秋萍

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于pPIC9K载体克隆表达基因的问题 已有2人参与

本人正在做将长度为2.2kb的基因片段连接到pPIC9K载体上,选的是ECOR 1和NOT 1酶切位点,用的是化学转化法,转化长出来的菌用菌落PCR鉴定得到几个能扩增出目的片段的转化子,然后提取质粒,发现质粒的大小不一,有的比pPIC9K空载体要小,有的比pPIC9K空载体要大。重复了很多次都是这样,然后就选了一个质粒最大的送去测序,发现目的片段在,酶切位点也在,酶切位点两端的序列也是pPIC9K载体的序列,这是怎么回事啊,求高手赐教,不胜感激!
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用的是化学转化法?为什么用这个,直接热激不就行了,又不是转酵母。
采菊东篱下,悠然见南山。
2楼2015-03-11 12:09:20
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钟秋萍

新虫 (初入文坛)

我说的化学转化法指的就是42度热激,你还有什么建议吗?谢谢
3楼2015-03-11 12:51:26
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果测序结果证明是in frame reading的话就不用管大小了,可能是提质粒试剂盒的问题。我跟你情况一样,但用的是pGAPZ ALPHA A这个质粒,貌似不表达,哭死。
4楼2015-03-11 13:54:01
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钟秋萍

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2015-03-11 13:54:01
如果测序结果证明是in frame reading的话就不用管大小了,可能是提质粒试剂盒的问题。我跟你情况一样,但用的是pGAPZ ALPHA A这个质粒,貌似不表达,哭死。

但是我还对这个质粒进行了酶切鉴定,发现少了个别线性化的酶切位点,我们觉得可能是pPIC9K载体不稳定,可能在中间某个地方断了导致载体少了一段,所以不能不管啊,如果载体不完整的话会影响以后的筛选和表达吧?
5楼2015-03-11 16:31:44
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 钟秋萍 at 2015-03-11 16:31:44
但是我还对这个质粒进行了酶切鉴定,发现少了个别线性化的酶切位点,我们觉得可能是pPIC9K载体不稳定,可能在中间某个地方断了导致载体少了一段,所以不能不管啊,如果载体不完整的话会影响以后的筛选和表达吧?...

载体一般稳定的吧,如果真的是不稳定,那会影响表达的
6楼2015-03-11 23:29:26
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