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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于pPIC9K载体克隆表达基因的问题
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钟秋萍

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于pPIC9K载体克隆表达基因的问题 已有2人参与

本人正在做将长度为2.2kb的基因片段连接到pPIC9K载体上，选的是ECOR 1和NOT 1酶切位点，用的是化学转化法，转化长出来的菌用菌落PCR鉴定得到几个能扩增出目的片段的转化子，然后提取质粒，发现质粒的大小不一，有的比pPIC9K空载体要小，有的比pPIC9K空载体要大。重复了很多次都是这样，然后就选了一个质粒最大的送去测序，发现目的片段在，酶切位点也在，酶切位点两端的序列也是pPIC9K载体的序列，这是怎么回事啊，求高手赐教，不胜感激！
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1楼 2015-03-11 11:36:19
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用的是化学转化法？为什么用这个，直接热激不就行了，又不是转酵母。
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采菊东篱下，悠然见南山。
2楼2015-03-11 12:09:20
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钟秋萍

新虫 (初入文坛)
我说的化学转化法指的就是42度热激，你还有什么建议吗？谢谢
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3楼2015-03-11 12:51:26
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果测序结果证明是in frame reading的话就不用管大小了，可能是提质粒试剂盒的问题。我跟你情况一样，但用的是pGAPZ ALPHA A这个质粒，貌似不表达，哭死。
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4楼2015-03-11 13:54:01
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钟秋萍

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2015-03-11 13:54:01
如果测序结果证明是in frame reading的话就不用管大小了，可能是提质粒试剂盒的问题。我跟你情况一样，但用的是pGAPZ ALPHA A这个质粒，貌似不表达，哭死。

但是我还对这个质粒进行了酶切鉴定，发现少了个别线性化的酶切位点，我们觉得可能是pPIC9K载体不稳定，可能在中间某个地方断了导致载体少了一段，所以不能不管啊，如果载体不完整的话会影响以后的筛选和表达吧？
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5楼2015-03-11 16:31:44
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 钟秋萍 at 2015-03-11 16:31:44
但是我还对这个质粒进行了酶切鉴定，发现少了个别线性化的酶切位点，我们觉得可能是pPIC9K载体不稳定，可能在中间某个地方断了导致载体少了一段，所以不能不管啊，如果载体不完整的话会影响以后的筛选和表达吧？...

载体一般稳定的吧，如果真的是不稳定，那会影响表达的
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6楼2015-03-11 23:29:26
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