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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光PCR 内控
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maweisimple

铁虫 (小有名气)

[交流] 荧光PCR 内控

大家好，最近在思考，实时荧光PCR的试剂往往除了阳性质控品，还添加另一种荧光信号的内控，有些不解，阳性质控品不就是证明试剂没问题的吗，如果阳性质控有信号，外控无信号，说明提取的样本有抑制，而反应试剂是没问题，为什么还要加内控呢？请大家各抒己见，不吝赐教！
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1楼 2015-02-10 13:44:12
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love_st

金虫 (著名写手)
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maweisimple: 金币+3, 很棒 2015-02-10 16:49:07
阳性质控，是为了说明你的试剂没有问题，由于阳性质控并不和你的具体的每一个样本一管扩增。而有时候某个样本是阴性，但是你无法判断是由于真的是阴性呢还是标本有抑制物导致的阴性，这时候就引入内控，也就是所谓的内标，它分两种，一种是管家基因，一种是额外添加进去的质粒或者其它（正常的样本内控或内标就肯定为阳性），和样本一起参与提取，这时候如果标本的目的片段是阴性，而内标也是阴性，说明这个标本可能有抑制物，因为连内标都没有出来，可以稀释下临床样本进行检测，而如果标本的目的片段是阴性，而内标是阳性，那么结果为正常，即，此份样本你的目的片段为阴性，不知道这样解释你是否明白。内标主要用来考察样本扩增的假阴性！
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3楼2015-02-10 15:57:42
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lovelydong

铜虫 (小有名气)
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maweisimple: 金币+1 2015-02-10 18:23:24
你说的外标是一段保守序列，和目的片段在同一段基因上对吧，在试剂正常前提下如果外标为阴性可能有两种原因：
1，样品中有抑制剂
2，样品中没有基因
这个时候你没法判断。如果加了内控，如果内控也是阴性，那么被抑制了；内控阳性，说明样品中没有基因。
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5楼2015-02-10 17:33:22
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love_st

金虫 (著名写手)
★
maweisimple: 金币+1, 2 2015-02-13 08:57:43
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10楼2015-02-12 08:38:42
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bbbobo

木虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
maweisimple: 金币+1, 谢谢 2015-02-10 16:53:34
内参一方面是证明试剂体系没问题，另一方面是进行相对定量
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2楼2015-02-10 15:16:59
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maweisimple

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by love_st at 2015-02-10 15:57:42
阳性质控，是为了说明你的试剂没有问题，由于阳性质控并不和你的具体的每一个样本一管扩增。而有时候某个样本是阴性，但是你无法判断是由于真的是阴性呢还是标本有抑制物导致的阴性，这时候就引入内控，也就是所谓的 ...

嗯嗯，但是针对每个样本，都做一个外控，是目的片段外的另一段保守序列，它如果能扩出来，阳性质控也能扩出来，就说明试剂没问题。如果外控不出，阳性也不出，说明试剂有问题。如果外控不出，阳性出，说明样本有抑制剂。不知道理解的对不对？如果是这样，还有必要加内控吗？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2015-02-10 16:48:20
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maweisimple

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lovelydong at 2015-02-10 17:33:22
你说的外标是一段保守序列，和目的片段在同一段基因上对吧，在试剂正常前提下如果外标为阴性可能有两种原因：
1，样品中有抑制剂
2，样品中没有基因
这个时候你没法判断。如果加了内控，如果内控也是阴性，那么被 ...

可是，检测前，是需要测定DNA浓度和纯度的。
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6楼2015-02-11 09:17:52
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lovelydong

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
maweisimple: 金币+1 2015-02-11 12:44:43
引用回帖:
6楼: Originally posted by maweisimple at 2015-02-11 09:17:52
可是，检测前，是需要测定DNA浓度和纯度的。...

测定的DNA是你提取的总DNA，未必含有你外标那段基因（当然也只有极端的情况才会出现这种情况），这个时候引入的各种阳性质控、外标以及内标才能发挥它们的作用，辅助你分析问题所在。不知道这样解释能否帮助你？
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maweisimple
7楼2015-02-11 10:28:57
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maweisimple

铁虫 (小有名气)
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引用回帖:
7楼: Originally posted by lovelydong at 2015-02-11 10:28:57
测定的DNA是你提取的总DNA，未必含有你外标那段基因（当然也只有极端的情况才会出现这种情况），这个时候引入的各种阳性质控、外标以及内标才能发挥它们的作用，辅助你分析问题所在。不知道这样解释能否帮助你？...

嗯嗯，明白。现在的问题是，内控扩增对我的目的片段扩增有很大干扰，尤其是低突变水平的，基本检不出来了，所以才不想加内控了。不知道有没有更好的办法？
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8楼2015-02-11 12:43:34
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love_st

金虫 (著名写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
maweisimple: 金币+1 2015-02-13 08:57:34
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9楼2015-02-12 08:38:13
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