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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR用10ul反应成吗？
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 荧光定量PCR用10ul反应成吗？

荧光定量PCR有人用过10ul反应吗？会不会太少了呀，我担心蒸发干了，有人用过10ul反应吗？多谢了。手机没法悬赏金币，电脑上的时候追加悬赏金币。


另外，这是我今天刚做的10ul体系的结果，不行啊，不知道是体系的问题还是试剂的问题呀我的cDNA和酶都只冻融过一次，在4℃融化之后用的，在冰上配制的混合液，在冰上加的样。大侠帮忙分析是哪儿的原因啊！


[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

[ Last edited by zhang8826857 on 2012-7-19 at 15:20 ]
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1楼 2012-07-17 23:36:04
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hxsm

金虫 (正式写手)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-19 15:21:31
zhang8826857: 金币+5, 谢谢 2012-09-21 16:24:54
曾经大规模数据都是用10的，没有一点问题，但是有时候也要看仪器和你的耗材，我整个流程几乎都是进口耗材，包括RNA的很多都是进口耗材，速度很快，这样的我5的体系也用过，其实没有什么问题的。。。移液枪，我是采用了一套全新的移液枪，用于整个实验流程。。。
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14楼2012-07-19 08:56:03
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普通回帖

love_st

金虫 (著名写手)
应该问题不大
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2楼2012-07-18 08:37:42
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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zhang8826857: 金币+5, 谢谢 2012-09-21 16:25:02
做过15的，10的没做过，感觉太少了吧，会不会加样误差大啊
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3楼2012-07-18 17:03:36
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starseacow

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★
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zhang8826857: 金币+2, 谢谢 2012-09-21 16:25:13
没问题，我以前做过。要用把好一点的移液枪，保证加样准确。
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4楼2012-07-18 17:28:47
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Rick001

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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zhang8826857: 金币+2, 谢谢 2012-09-21 16:25:19
太少了应该会影响复孔之间的差距以及重现性。
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5楼2012-07-18 18:33:12
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shenye.judy

木虫 (正式写手)
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zhang8826857: 金币+5, 谢谢 2012-09-21 16:25:26
你的PCR管子和仪器只要配套，就没问题，我做过！
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6楼2012-07-18 19:34:53
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tupac225

金虫 (正式写手)
★
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我觉得pcr的体系最好还是20ul的体系最好，误差较小，你这么做事为了节约试剂吗？没有必要的，实验结果最重要。
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9楼2012-07-18 22:07:43
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328533973

金虫 (正式写手)
有点少了，一般20以上
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10楼2012-07-18 22:38:07
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bus1010

铁虫 (初入文坛)
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zhang8826857: 金币+5, 谢谢 2012-09-21 16:25:43
我们室用的12.5ul反应体积。10ul体系+2.5模板，与25ul（20+5）比对过，没问题
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12楼2012-07-19 00:20:31
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webmasterone752

金虫 (正式写手)
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zhang8826857: 金币+3, 谢谢 2012-09-21 16:25:49
我做的是15的，没问题。
实验室也有人做10的，保证加样准确就没问题。
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13楼2012-07-19 08:28:21
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zhcosa

金虫 (小有名气)
做过对比，木有问题～
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15楼2012-07-19 13:32:12
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bbwalkman

木虫 (小有名气)
应该还好，别太少了吧
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16楼2012-07-19 14:44:35
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yanzongwei

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
17楼2012-07-19 14:56:02
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cll881125

新虫 (初入文坛)
★
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我们做的荧光PCR都是20以上的，做过25、30、40、50,但是没做过10的体系，25的体系跑完后还可以测序的。
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18楼2012-07-19 15:37:29
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
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zhang8826857: 金币+3, 谢谢 2012-09-21 16:26:07
我们这边都是用10uL的。我最早用20uL，后来看旁边几家课题组都是10uL，也换成10uL的了。耗材方面，我们的是AB的机器没办法只能用原厂耗材，其他实验室都用Axygen的耗材。
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19楼2012-07-19 15:46:56
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
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我常用的体系是这样的（Takara的试剂盒）：

SYBR Premix Ex Taq (2X)        5 μL
Primer 1 (2 μM)                       1 μL
Primer 2 (2 μM)                       1 μL
cDNA (相当于50 ng RNA）      1 μL
水                                            2 μL
---------------------------------------------------------
Total                                      10 μL

我们普通PCR时引物是10 μM的，为了使体积不至于太小，做定量PCR的引物我就用2 μM的了。cDNA的用量可根据需要再调整。
另外，ROX是事先加入整管SYBR Premix Ex Taq里面的，体积很小就忽略了。

[ Last edited by 西瓜 on 2012-7-19 at 16:07 ]
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20楼2012-07-19 16:03:19
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)
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zhang8826857: 金币+3, 谢谢 2012-09-21 16:26:26
用ABI的机器，384孔板做10 uL体系很好的，没啥问题，注意实验的细节，贴膜之后挥发性的问题影响很小
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21楼2012-07-20 08:38:11
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84146922

金虫 (小有名气)
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zhang8826857: 金币+3, 谢谢 2012-09-21 16:26:37
不会，本人曾经试过10微升体系，没有问题，依然稳定
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22楼2012-07-20 11:43:34
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