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汕头大学海洋科学接受调剂
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)


[交流] 荧光定量PCR用10ul反应成吗?

荧光定量PCR有人用过10ul反应吗?会不会太少了呀,我担心蒸发干了,有人用过10ul反应吗?多谢了。手机没法悬赏金币,电脑上的时候追加悬赏金币。


另外,这是我今天刚做的10ul体系的结果,不行啊,不知道是体系的问题还是试剂的问题呀我的cDNA和酶都只冻融过一次,在4℃融化之后用的,在冰上配制的混合液,在冰上加的样。大侠帮忙分析是哪儿的原因啊!


[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

[ Last edited by zhang8826857 on 2012-7-19 at 15:20 ]
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我常用的体系是这样的(Takara的试剂盒):

SYBR Premix Ex Taq (2X)        5 μL
Primer 1 (2 μM)                       1 μL
Primer 2 (2 μM)                       1 μL
cDNA (相当于50 ng RNA)      1 μL
水                                            2 μL
---------------------------------------------------------
Total                                      10 μL

我们普通PCR时引物是10 μM的,为了使体积不至于太小,做定量PCR的引物我就用2 μM的了。cDNA的用量可根据需要再调整。
另外,ROX是事先加入整管SYBR Premix Ex Taq里面的,体积很小就忽略了。

[ Last edited by 西瓜 on 2012-7-19 at 16:07 ]
20楼2012-07-19 16:03:19
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)


★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
zhang8826857: 金币+5, 谢谢 2012-09-21 16:25:02
做过15的,10的没做过,感觉太少了吧,会不会加样误差大啊
3楼2012-07-18 17:03:36
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★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
zhang8826857: 金币+2, 谢谢 2012-09-21 16:25:13
没问题,我以前做过。要用把好一点的移液枪,保证加样准确。
4楼2012-07-18 17:28:47
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Rick001

铁杆木虫 (职业作家)


★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
zhang8826857: 金币+2, 谢谢 2012-09-21 16:25:19
太少了应该会影响复孔之间的差距以及重现性。
5楼2012-07-18 18:33:12
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