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抓药的金虫 (正式写手)
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western一直做不出来，呈上实验步骤，请大仙指教。 已有6人参与
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一、细胞裂解 1、取24孔板每孔加100μL细胞，900μL培养基。待细胞长满。 2、tofacitinib,及LDYS-14007加样液的制备 分别取5mg tofacitinib,4.4mg LDYS-14007，各溶解在1mlDMSO中，分别制成10mmol的母液。 （1）取20μL 10mmol的母液，80μL DMSO ，制成2mmol的药液。 （2）取10μL 2mmol的药液,90μL DMSO制成200μmol的药液。 （3）取10μL 200μmol的药液,90μLDMSO制成20μmol的药液。 （4）取10μL 20μmol的药液,90μLDMSO制成2μmol的药液。 （5）取10μL 2μmol的药液,90μLDMSO制成200nmol的药液。 然后依次标记成1-5号。 2、刺激因子的配制 取白介-11 1.5mg，溶于15ml水中，配成100μg/ml的药液 3、实验步骤 ①取24ml培养液温浴，然后分装到24个EP管中，将配好的Tofacitinib药液按顺序加到10个EP管中，混匀后加到24孔板上。在培养箱培养1小时（LDYS-14007同理操作） 加入溶液 终体积 终浓度 200μmol、5μL 1ml 1μmol 200μmol、1μL 1ml 200nmol 20μmol、2μL 1ml 40nmol 2μmol、 4μL 1ml 8nmol 200nmol、8μL 1ml 1.6nmol ②将1中的培养基吸出800μL按顺序加到EP管中，除空白对照外每个管中加3μL白介-11。温育10分钟。 ③将培养基去除，加PBS洗一次。每孔加100μL SDS loading buffer。用枪头在孔中搅拌20次（每孔相同的搅拌次数），将液体吸入到EP管，每吸一个孔换一个枪头，按顺序标记好后离心，在100度水浴10分钟。-80冰箱保存。 二、western步骤 1、制胶：配8%的分离胶，然后加浓缩胶 2、上样：tofacitinib处理的样品，上样顺序（LDYS-14007同理操作） Loading buffer + 1 2 mark 3 4 5 - Loading buffer 3、电泳：浓缩胶180V，分离胶120V 4、转膜：半干转膜法转膜40分钟 5、封闭：封闭液5%BSA-TBST 1月23号配制，封闭1小时，TBST洗两次，每次5min. 6、一抗：将每张膜在中间剪开，一半上JAK2抗体，一半上β-actin抗体 jak2 1:2000稀释 1月26号配制，β-actin 1:3000稀释2月2号配制 常温过夜（忘记放4度冰箱了）。TBST洗两次，每次5min. 7、二抗：二抗1:10000稀释 1月27号配制，常温2小时，TBST洗10分钟 8、显影：加发光液，然后压片（15分钟以上），洗片，重复几次，结果片子都是空白。 |
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