| 查看: 2006 | 回复: 11 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
抓药的金虫 (正式写手)
|
[求助]
western一直做不出来，呈上实验步骤，请大仙指教。 已有6人参与
|
|
|
一、细胞裂解 1、取24孔板每孔加100μL细胞，900μL培养基。待细胞长满。 2、tofacitinib,及LDYS-14007加样液的制备 分别取5mg tofacitinib,4.4mg LDYS-14007，各溶解在1mlDMSO中，分别制成10mmol的母液。 （1）取20μL 10mmol的母液，80μL DMSO ，制成2mmol的药液。 （2）取10μL 2mmol的药液,90μL DMSO制成200μmol的药液。 （3）取10μL 200μmol的药液,90μLDMSO制成20μmol的药液。 （4）取10μL 20μmol的药液,90μLDMSO制成2μmol的药液。 （5）取10μL 2μmol的药液,90μLDMSO制成200nmol的药液。 然后依次标记成1-5号。 2、刺激因子的配制 取白介-11 1.5mg，溶于15ml水中，配成100μg/ml的药液 3、实验步骤 ①取24ml培养液温浴，然后分装到24个EP管中，将配好的Tofacitinib药液按顺序加到10个EP管中，混匀后加到24孔板上。在培养箱培养1小时（LDYS-14007同理操作） 加入溶液 终体积 终浓度 200μmol、5μL 1ml 1μmol 200μmol、1μL 1ml 200nmol 20μmol、2μL 1ml 40nmol 2μmol、 4μL 1ml 8nmol 200nmol、8μL 1ml 1.6nmol ②将1中的培养基吸出800μL按顺序加到EP管中，除空白对照外每个管中加3μL白介-11。温育10分钟。 ③将培养基去除，加PBS洗一次。每孔加100μL SDS loading buffer。用枪头在孔中搅拌20次（每孔相同的搅拌次数），将液体吸入到EP管，每吸一个孔换一个枪头，按顺序标记好后离心，在100度水浴10分钟。-80冰箱保存。 二、western步骤 1、制胶：配8%的分离胶，然后加浓缩胶 2、上样：tofacitinib处理的样品，上样顺序（LDYS-14007同理操作） Loading buffer + 1 2 mark 3 4 5 - Loading buffer 3、电泳：浓缩胶180V，分离胶120V 4、转膜：半干转膜法转膜40分钟 5、封闭：封闭液5%BSA-TBST 1月23号配制，封闭1小时，TBST洗两次，每次5min. 6、一抗：将每张膜在中间剪开，一半上JAK2抗体，一半上β-actin抗体 jak2 1:2000稀释 1月26号配制，β-actin 1:3000稀释2月2号配制 常温过夜（忘记放4度冰箱了）。TBST洗两次，每次5min. 7、二抗：二抗1:10000稀释 1月27号配制，常温2小时，TBST洗10分钟 8、显影：加发光液，然后压片（15分钟以上），洗片，重复几次，结果片子都是空白。 |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有195人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- western blot
已经有8人回复
- 裂解液裂解的细胞，想在做WESTERN之前测一下蛋白的浓度，应该用什么方法？
已经有4人回复
- western一直做不出来，想测一下抗体是否失效有什么方法可以测？
已经有6人回复
- 请教一个western blot的问题，急需答案，谢谢！！！！
已经有28人回复
- western blot小分子检测不出
已经有6人回复
- western blot 求助
已经有9人回复
- 想检测一个大约4kD 的小肽片段，western blot 一直没有条带怎么办
已经有21人回复
- western
已经有3人回复
- Western Blot 经验
已经有36人回复
- 大家做western blot 都用多巴胺受体1（D1R）的抗体都有哪些厂家 哪些牌子的啊
已经有4人回复
- western的转膜液配方
已经有6人回复
- western实验问题
已经有8人回复
- 求高手解答 western 蛋白分散在泳道两边
已经有3人回复
- western blot
已经有17人回复
- western blot 一抗孵育时用多少ml啊
已经有15人回复
- SOCS1 WESTERN
已经有1人回复
- western结果跟考马斯兰，质谱结果不符合！
已经有3人回复
- western各个条带间有分界线or点是怎么回事
已经有22人回复
- western-blot显完色整个泳道都亮是怎么回事
已经有11人回复
- 如何做 Western blot 以及RT-PCR 的加药处理时间梯度？细胞数量如何统一？
已经有9人回复
- western blot 遇到困难 请求帮助！！！
已经有6人回复
- 跪求各位高人：这个Western 到底出什么问题了啊
已经有9人回复
- Western Blot的问题（关于重复性和显色）
已经有11人回复
- WESTERN跑出这样的蓝色BUFFER形状
已经有8人回复
- western求助
已经有1人回复
- 【求助/交流】western blot 一直都跑不出来，不知道原因，大侠给分析一下啊！？
已经有13人回复
781055707
木虫 (著名写手)
- 应助: 291 (大学生)
- 金币: 3118.2
- 散金: 46
- 红花: 19
- 帖子: 2030
- 在线: 579.3小时
- 虫号: 3046113
- 注册: 2014-03-13
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
7楼2015-02-04 10:11:21
3楼2015-02-03 19:55:39
抓药的
金虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1027.3
- 散金: 294
- 红花: 23
- 帖子: 716
- 在线: 135.9小时
- 虫号: 3052349
- 注册: 2014-03-14
- 性别: MM
- 专业: 生物技术药物
4楼2015-02-03 20:24:20
5楼2015-02-04 09:50:38