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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[求助] western blot

最近在做wb,但是一直都不出结果,也换了新的抗体,还是不行,哪位大侠可以帮我分析一下这是什么原因啊,图片已经上传了,样品1的蛋白预测分子量是27kd,样品2的蛋白预测分子量为20kd,从sds-page上看的话与对照比较是在预测分子量大小有表达的,但是wb却不显色,这是为什么啊,难道那就不是我的蛋白?!大侠们,帮帮忙吧,真的快被折腾疯了,老板各种催各种逼啊
western blot
1.jpg
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-08-29 13:22:37
用的什么抗体?his-tag吗?样品是什么?是普通的粗提,还是IPTG诱导表达?此外,你的电泳有5道,你只标了3个,另外两个是什么?
2楼2013-08-29 13:06:08
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江南

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-08-29 21:21:41
用的是his抗体吗?
如果WB折腾不出来就直接切胶质谱鉴定或N端测序好了,一个条带才几百块,很快出结果而且很准确
3楼2013-08-29 13:53:38
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-29 13:06:08
用的什么抗体?his-tag吗?样品是什么?是普通的粗提,还是IPTG诱导表达?此外,你的电泳有5道,你只标了3个,另外两个是什么?

不是his-tag的,样品是菌的破碎上清,样品1左边那个是破碎沉淀,右边是没有破碎的菌直接水溶以后上的样。
4楼2013-08-29 14:25:49
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 江南 at 2013-08-29 13:53:38
用的是his抗体吗?
如果WB折腾不出来就直接切胶质谱鉴定或N端测序好了,一个条带才几百块,很快出结果而且很准确

额,不是his抗体,为什么都这么问啊?wb不应该灵敏度挺高的吗?!为什么会出这种的结果呢?
5楼2013-08-29 14:59:49
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charlie9

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
一抗或二抗都有可能不好使。楼主何不切胶去测序。
6楼2013-08-29 15:10:14
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流 2013-08-29 20:23:20
你的一抗貌似有问题吧,对照你没有说明是否为阳性对照,我猜测是阳性的。你看看你的对照都没有出现特异的条带,不过你也可以看看WB出现了多少的非特异带,从图片分析一抗有问题的可能性大。
7楼2013-08-29 16:59:10
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
飘零的叶子(amisking代发): 金币+2, 鼓励发帖交流 2013-08-29 20:23:31
"样品是菌的破碎上清".
蛋白是包涵体的话,那不出来也很正常了。
什么标签,什么抗体,说清楚还是很重要的。
生命不息,探索不止。
8楼2013-08-29 17:08:28
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by charlie9 at 2013-08-29 15:10:14
一抗或二抗都有可能不好使。楼主何不切胶去测序。

额,一抗是刚刚换过新的,是AB CAM的
9楼2013-08-29 18:27:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-30 13:41:48
引用回帖:
4楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-08-29 14:25:49
不是his-tag的,样品是菌的破碎上清,样品1左边那个是破碎沉淀,右边是没有破碎的菌直接水溶以后上的样。...

细菌在蛋白loading buffer里也会部分破碎,煮过后会完全破碎。所以所谓没有破碎的菌应该也算是全菌蛋白了。至于为什么抗体不识别,可能是所用抗体的特异性问题,或者是western本身没有做好。如果你能在考染的胶上看到目标条带,可以试试n-terminal sequencing,或者直接打质谱。
10楼2013-08-30 00:25:10
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