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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[求助] western blot

最近在做wb，但是一直都不出结果，也换了新的抗体，还是不行，哪位大侠可以帮我分析一下这是什么原因啊，图片已经上传了，样品1的蛋白预测分子量是27kd，样品2的蛋白预测分子量为20kd，从sds-page上看的话与对照比较是在预测分子量大小有表达的，但是wb却不显色，这是为什么啊，难道那就不是我的蛋白？！大侠们，帮帮忙吧，真的快被折腾疯了，老板各种催各种逼啊
western blot
1.jpg
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1楼 2013-08-29 09:40:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-29 13:22:37
用的什么抗体？his-tag吗？样品是什么？是普通的粗提，还是IPTG诱导表达？此外，你的电泳有5道，你只标了3个，另外两个是什么？
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2楼2013-08-29 13:06:08
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江南

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-08-29 21:21:41
用的是his抗体吗？
如果WB折腾不出来就直接切胶质谱鉴定或N端测序好了，一个条带才几百块，很快出结果而且很准确
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3楼2013-08-29 13:53:38
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-29 13:06:08
用的什么抗体？his-tag吗？样品是什么？是普通的粗提，还是IPTG诱导表达？此外，你的电泳有5道，你只标了3个，另外两个是什么？

不是his-tag的，样品是菌的破碎上清，样品1左边那个是破碎沉淀，右边是没有破碎的菌直接水溶以后上的样。
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4楼2013-08-29 14:25:49
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 江南 at 2013-08-29 13:53:38
用的是his抗体吗？
如果WB折腾不出来就直接切胶质谱鉴定或N端测序好了，一个条带才几百块，很快出结果而且很准确

额，不是his抗体，为什么都这么问啊？wb不应该灵敏度挺高的吗？！为什么会出这种的结果呢？
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5楼2013-08-29 14:59:49
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charlie9

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一抗或二抗都有可能不好使。楼主何不切胶去测序。
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6楼2013-08-29 15:10:14
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流 2013-08-29 20:23:20
你的一抗貌似有问题吧，对照你没有说明是否为阳性对照，我猜测是阳性的。你看看你的对照都没有出现特异的条带，不过你也可以看看WB出现了多少的非特异带，从图片分析一抗有问题的可能性大。
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7楼2013-08-29 16:59:10
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
飘零的叶子(amisking代发): 金币+2, 鼓励发帖交流 2013-08-29 20:23:31
"样品是菌的破碎上清".
蛋白是包涵体的话，那不出来也很正常了。
什么标签，什么抗体，说清楚还是很重要的。
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生命不息，探索不止。
8楼2013-08-29 17:08:28
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by charlie9 at 2013-08-29 15:10:14
一抗或二抗都有可能不好使。楼主何不切胶去测序。

额，一抗是刚刚换过新的，是AB CAM的
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9楼2013-08-29 18:27:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-30 13:41:48
引用回帖:
4楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-08-29 14:25:49
不是his-tag的，样品是菌的破碎上清，样品1左边那个是破碎沉淀，右边是没有破碎的菌直接水溶以后上的样。...

细菌在蛋白loading buffer里也会部分破碎，煮过后会完全破碎。所以所谓没有破碎的菌应该也算是全菌蛋白了。至于为什么抗体不识别，可能是所用抗体的特异性问题，或者是western本身没有做好。如果你能在考染的胶上看到目标条带，可以试试n-terminal sequencing，或者直接打质谱。
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10楼2013-08-30 00:25:10
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