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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western一直做不出来，呈上实验步骤，请大仙指教。
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抓药的

金虫 (正式写手)

[求助] western一直做不出来，呈上实验步骤，请大仙指教。 已有6人参与

一、细胞裂解
1、取24孔板每孔加100μL细胞，900μL培养基。待细胞长满。
2、tofacitinib,及LDYS-14007加样液的制备
分别取5mg tofacitinib,4.4mg LDYS-14007，各溶解在1mlDMSO中，分别制成10mmol的母液。
（1）取20μL 10mmol的母液，80μL DMSO ，制成2mmol的药液。
（2）取10μL 2mmol的药液,90μL DMSO制成200μmol的药液。
（3）取10μL 200μmol的药液,90μLDMSO制成20μmol的药液。
（4）取10μL 20μmol的药液,90μLDMSO制成2μmol的药液。
（5）取10μL 2μmol的药液,90μLDMSO制成200nmol的药液。  
然后依次标记成1-5号。
2、刺激因子的配制
取白介-11 1.5mg，溶于15ml水中，配成100μg/ml的药液
3、实验步骤
①取24ml培养液温浴，然后分装到24个EP管中，将配好的Tofacitinib药液按顺序加到10个EP管中，混匀后加到24孔板上。在培养箱培养1小时（LDYS-14007同理操作）
加入溶液                 终体积        终浓度
200μmol、5μL        1ml        1μmol
200μmol、1μL        1ml        200nmol
20μmol、2μL        1ml        40nmol
2μmol、 4μL        1ml        8nmol
200nmol、8μL        1ml        1.6nmol

②将1中的培养基吸出800μL按顺序加到EP管中，除空白对照外每个管中加3μL白介-11。温育10分钟。
③将培养基去除，加PBS洗一次。每孔加100μL SDS loading buffer。用枪头在孔中搅拌20次（每孔相同的搅拌次数），将液体吸入到EP管，每吸一个孔换一个枪头，按顺序标记好后离心，在100度水浴10分钟。-80冰箱保存。
二、western步骤
1、制胶：配8%的分离胶，然后加浓缩胶
2、上样：tofacitinib处理的样品，上样顺序（LDYS-14007同理操作）
Loading buffer  +  1   2  mark  3   4   5  -   Loading buffer

3、电泳：浓缩胶180V，分离胶120V
4、转膜：半干转膜法转膜40分钟
5、封闭：封闭液5%BSA-TBST 1月23号配制，封闭1小时，TBST洗两次，每次5min.
6、一抗：将每张膜在中间剪开，一半上JAK2抗体，一半上β-actin抗体
jak2 1:2000稀释 1月26号配制，β-actin 1:3000稀释2月2号配制
常温过夜（忘记放4度冰箱了）。TBST洗两次，每次5min.
7、二抗：二抗1:10000稀释 1月27号配制，常温2小时，TBST洗10分钟
8、显影：加发光液，然后压片（15分钟以上），洗片，重复几次，结果片子都是空白。
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1楼 2015-02-03 17:35:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Allen206

银虫 (小有名气)
问题比较多，交给我们做吧，
赞一下(2人) 回复此楼
不想说什么，，，，
6楼2015-02-04 10:09:42
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yuzhoumeinv

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
抓药的: 金币+1 2015-02-03 20:22:13
片子是空白的，可以把膜拿回去用TBST洗5分钟，增高二抗浓度，例如1:5000或1:2000，然后加显色剂再显影看看，如果片子不是空白说明是一抗或者二抗浓度不合适，如果还是空白可能是样品制备或者转膜的问题了。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2015-02-03 19:55:39
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
抓药的: 金币+1 2015-02-04 16:44:07
抓药的(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-02-04 20:31:06
1浓缩胶180V，80v就可以了，这个太高了。
2转膜的话你目的蛋白多大，70以下的话1小时左右,70以上就三四个小时了。
3洗涤的话一般都洗三次以上，每次7MIN以上，减小背景。
4二抗浓度太低，1比2000
5做个其他蛋白的对照，检验下你的一抗，二抗，这东西也是会出问题的。
千里之堤毁于蚁穴，在不行，可能是你的蛋白没表达出来，用考马斯染下看看有无目的条带。
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采菊东篱下，悠然见南山。
7楼2015-02-04 10:11:21
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普通回帖

DRMF89

新虫 (著名写手)
太高端，不懂
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2楼2015-02-03 18:04:32
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抓药的

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuzhoumeinv at 2015-02-03 19:55:39
片子是空白的，可以把膜拿回去用TBST洗5分钟，增高二抗浓度，例如1:5000或1:2000，然后加显色剂再显影看看，如果片子不是空白说明是一抗或者二抗浓度不合适，如果还是空白可能是样品制备或者转膜的问题了。

第一张片子上面有几块黑斑，第二张什么也没有。这是什么原因？
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4楼2015-02-03 20:24:20
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yuzhoumeinv

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
抓药的(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-04 20:30:54
引用回帖:
4楼: Originally posted by 抓药的 at 2015-02-03 20:24:20
第一张片子上面有几块黑斑，第二张什么也没有。这是什么原因？...

两张压片时间不同，第一张压片应该比较长吧，这样看来应该是二抗1:10000不太合适，你可以试一下我之前说的二抗改到1:5000甚至1:2000，我曾经也是这样的结果，改了比例就好了
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5楼2015-02-04 09:50:38
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zhao_chenc

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
抓药的: 金币+1 2015-02-04 16:43:55
抓药的(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-04 20:31:20
封闭液用5%脱脂奶粉
TBST洗涤时间延长
电压降低点
确定你的发光液没有过期
还有用粗的上样孔多多上样试试，至少要先要看到条带吧
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8楼2015-02-04 15:05:31
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buzisheng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
抓药的: 金币+1 2015-02-04 16:43:45
半干法转膜一般适用于100kDa以下的蛋白，你用8%的胶，蛋白也大不了，转膜15分钟足够了
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9楼2015-02-04 16:38:23
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抓药的

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Allen206 at 2015-02-04 10:09:42
问题比较多，交给我们做吧，

具体啥原因给说说吗
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10楼2015-02-04 16:44:49
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