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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western一直做不出来，呈上实验步骤，请大仙指教。
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抓药的

金虫 (正式写手)

[求助] western一直做不出来，呈上实验步骤，请大仙指教。 已有6人参与

一、细胞裂解
1、取24孔板每孔加100μL细胞，900μL培养基。待细胞长满。
2、tofacitinib,及LDYS-14007加样液的制备
分别取5mg tofacitinib,4.4mg LDYS-14007，各溶解在1mlDMSO中，分别制成10mmol的母液。
（1）取20μL 10mmol的母液，80μL DMSO ，制成2mmol的药液。
（2）取10μL 2mmol的药液,90μL DMSO制成200μmol的药液。
（3）取10μL 200μmol的药液,90μLDMSO制成20μmol的药液。
（4）取10μL 20μmol的药液,90μLDMSO制成2μmol的药液。
（5）取10μL 2μmol的药液,90μLDMSO制成200nmol的药液。  
然后依次标记成1-5号。
2、刺激因子的配制
取白介-11 1.5mg，溶于15ml水中，配成100μg/ml的药液
3、实验步骤
①取24ml培养液温浴，然后分装到24个EP管中，将配好的Tofacitinib药液按顺序加到10个EP管中，混匀后加到24孔板上。在培养箱培养1小时（LDYS-14007同理操作）
加入溶液                 终体积        终浓度
200μmol、5μL        1ml        1μmol
200μmol、1μL        1ml        200nmol
20μmol、2μL        1ml        40nmol
2μmol、 4μL        1ml        8nmol
200nmol、8μL        1ml        1.6nmol

②将1中的培养基吸出800μL按顺序加到EP管中，除空白对照外每个管中加3μL白介-11。温育10分钟。
③将培养基去除，加PBS洗一次。每孔加100μL SDS loading buffer。用枪头在孔中搅拌20次（每孔相同的搅拌次数），将液体吸入到EP管，每吸一个孔换一个枪头，按顺序标记好后离心，在100度水浴10分钟。-80冰箱保存。
二、western步骤
1、制胶：配8%的分离胶，然后加浓缩胶
2、上样：tofacitinib处理的样品，上样顺序（LDYS-14007同理操作）
Loading buffer  +  1   2  mark  3   4   5  -   Loading buffer

3、电泳：浓缩胶180V，分离胶120V
4、转膜：半干转膜法转膜40分钟
5、封闭：封闭液5%BSA-TBST 1月23号配制，封闭1小时，TBST洗两次，每次5min.
6、一抗：将每张膜在中间剪开，一半上JAK2抗体，一半上β-actin抗体
jak2 1:2000稀释 1月26号配制，β-actin 1:3000稀释2月2号配制
常温过夜（忘记放4度冰箱了）。TBST洗两次，每次5min.
7、二抗：二抗1:10000稀释 1月27号配制，常温2小时，TBST洗10分钟
8、显影：加发光液，然后压片（15分钟以上），洗片，重复几次，结果片子都是空白。
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1楼 2015-02-03 17:35:51
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buzisheng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
抓药的: 金币+1 2015-02-04 16:43:45
半干法转膜一般适用于100kDa以下的蛋白，你用8%的胶，蛋白也大不了，转膜15分钟足够了
赞一下 回复此楼
9楼2015-02-04 16:38:23
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yuzhoumeinv

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
抓药的: 金币+1 2015-02-03 20:22:13
片子是空白的，可以把膜拿回去用TBST洗5分钟，增高二抗浓度，例如1:5000或1:2000，然后加显色剂再显影看看，如果片子不是空白说明是一抗或者二抗浓度不合适，如果还是空白可能是样品制备或者转膜的问题了。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2015-02-03 19:55:39
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抓药的

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuzhoumeinv at 2015-02-03 19:55:39
片子是空白的，可以把膜拿回去用TBST洗5分钟，增高二抗浓度，例如1:5000或1:2000，然后加显色剂再显影看看，如果片子不是空白说明是一抗或者二抗浓度不合适，如果还是空白可能是样品制备或者转膜的问题了。

第一张片子上面有几块黑斑，第二张什么也没有。这是什么原因？
赞一下 回复此楼
4楼2015-02-03 20:24:20
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yuzhoumeinv

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
抓药的(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-04 20:30:54
引用回帖:
4楼: Originally posted by 抓药的 at 2015-02-03 20:24:20
第一张片子上面有几块黑斑，第二张什么也没有。这是什么原因？...

两张压片时间不同，第一张压片应该比较长吧，这样看来应该是二抗1:10000不太合适，你可以试一下我之前说的二抗改到1:5000甚至1:2000，我曾经也是这样的结果，改了比例就好了
赞一下 回复此楼
5楼2015-02-04 09:50:38
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