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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 筛选阳性克隆
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

[求助] 筛选阳性克隆 已有8人参与

利用菌落PCR进行阳筛，为什么筛不出来？一直没有条带。。。求答疑和建议
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1楼 2015-01-23 21:36:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

still2008

至尊木虫 (著名写手)

破碎世界的守护者

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yuman0709(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-25 18:20:23
空载吧，觉得是转化的问题。
（以前做的时候都懒，菌液不经沸水处理，从摇床上取下直接作模板。）

[ 发自小木虫客户端 ]
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有时一本正经，有时胡言乱语。
10楼2015-01-25 08:41:10
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普通回帖

稻稻

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yuman0709(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-24 20:47:17
确定引物和反应条件都没问题吗？如果是，那就说明长出的菌斑是假阳性。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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做一个不动声色的人，不准情绪化，不准回头看。
2楼2015-01-23 23:56:32
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huangchj03

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你需要把你的实验详细介绍一下，你这样太笼统，我们看不出你采用什么引物？蓝白斑结果？PCR条件？等
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3楼2015-01-24 13:37:28
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yuman0709(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-25 18:20:44
有可能是空克隆或者说你做一下阳性对照
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4楼2015-01-24 14:57:59
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2015-01-24 14:57:59
有可能是空克隆或者说你做一下阳性对照

我用质粒做阳性对照是有条带的，挑了好几批，难道我挑的一直是空载？
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5楼2015-01-24 15:41:25
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huangchj03 at 2015-01-24 13:37:28
你需要把你的实验详细介绍一下，你这样太笼统，我们看不出你采用什么引物？蓝白斑结果？PCR条件？等

弱弱的问：什么引物是什么意思？我采用的是EcoR1和BamH1酶切位点，对双酶切后的目的基因和质粒进行跑胶，条带也对，但连接产物没有跑胶，就直接转化了，采用的是卡那抗性平板，我是先将菌培养过夜，再将菌液进行100度，煮沸5min，PCR条件是95C  5min,95C  30s,55C  30s,72C  2min,72C  8min。还有做的阳性对照是有条带的。现在是我做什么实验都做不出来，对易错PCR条件Mg2+、Mn2+进行条件摸索，不知为什么，条件和体系都是一样的，但每次的结果都不一样，而且正常PCR体系，时而有条带时而没有条带，搞不懂为什么？真的很捉急啊！
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6楼2015-01-24 16:07:15
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 稻稻 at 2015-01-23 23:56:32
确定引物和反应条件都没问题吗？如果是，那就说明长出的菌斑是假阳性。

恩，我觉得都没有问题，因为阳性对照是有条带的，假阳性那么多？我重新转化了两次，都挑不出来阳性克隆，问题出现在哪了？
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7楼2015-01-24 16:11:05
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荷叶连连

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yuman0709(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-25 18:20:56
我以前的实验有过类似情况，也找不到原因。最后我从目的片段获得和酶切连接转化开始重新做了，还将实验中用的抗生素换新的并提高筛选压才获得比较满意的结果。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2015-01-25 06:37:50
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夏菡小屋

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yuman0709(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-25 18:21:04
建议挑几个菌提个质粒验证一下。感觉连接有问题。

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9楼2015-01-25 08:27:02
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