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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 筛选阳性克隆已有8人参与

利用菌落PCR进行阳筛，为什么筛不出来？一直没有条带。。。求答疑和建议

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1楼 2015-01-23 21:36:27

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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

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引用回帖:

3楼: Originally posted by huangchj03 at 2015-01-24 13:37:28
你需要把你的实验详细介绍一下，你这样太笼统，我们看不出你采用什么引物？蓝白斑结果？PCR条件？等

弱弱的问：什么引物是什么意思？我采用的是EcoR1和BamH1酶切位点，对双酶切后的目的基因和质粒进行跑胶，条带也对，但连接产物没有跑胶，就直接转化了，采用的是卡那抗性平板，我是先将菌培养过夜，再将菌液进行100度，煮沸5min，PCR条件是95C 5min,95C 30s,55C 30s,72C 2min,72C 8min。还有做的阳性对照是有条带的。现在是我做什么实验都做不出来，对易错PCR条件Mg2+、Mn2+进行条件摸索，不知为什么，条件和体系都是一样的，但每次的结果都不一样，而且正常PCR体系，时而有条带时而没有条带，搞不懂为什么？真的很捉急啊！