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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

[求助] 筛选阳性克隆 已有8人参与

利用菌落PCR进行阳筛,为什么筛不出来?一直没有条带。。。求答疑和建议
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by huangchj03 at 2015-01-24 13:37:28
你需要把你的实验详细介绍一下,你这样太笼统,我们看不出你采用什么引物?蓝白斑结果?PCR条件?等

弱弱的问:什么引物是什么意思?我采用的是EcoR1和BamH1酶切位点,对双酶切后的目的基因和质粒进行跑胶,条带也对,但连接产物没有跑胶,就直接转化了,采用的是卡那抗性平板,我是先将菌培养过夜,再将菌液进行100度,煮沸5min,PCR条件是95C  5min,95C  30s,55C  30s,72C  2min,72C  8min。还有做的阳性对照是有条带的。现在是我做什么实验都做不出来,对易错PCR条件Mg2+、Mn2+进行条件摸索,不知为什么,条件和体系都是一样的,但每次的结果都不一样,而且正常PCR体系,时而有条带时而没有条带,搞不懂为什么?真的很捉急啊!
6楼2015-01-24 16:07:15
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稻稻

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
yuman0709(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-24 20:47:17
确定引物和反应条件都没问题吗?如果是,那就说明长出的菌斑是假阳性。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
做一个不动声色的人,不准情绪化,不准回头看。
2楼2015-01-23 23:56:32
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huangchj03

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你需要把你的实验详细介绍一下,你这样太笼统,我们看不出你采用什么引物?蓝白斑结果?PCR条件?等
3楼2015-01-24 13:37:28
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
yuman0709(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-25 18:20:44
有可能是空克隆或者说你做一下阳性对照
4楼2015-01-24 14:57:59
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