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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 筛选阳性克隆
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 荷叶连连 at 2015-01-25 06:37:50
我以前的实验有过类似情况，也找不到原因。最后我从目的片段获得和酶切连接转化开始重新做了，还将实验中用的抗生素换新的并提高筛选压才获得比较满意的结果。
...

恩，谢谢啦啊！
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11楼2015-01-25 14:23:10
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 夏菡小屋 at 2015-01-25 08:27:02
建议挑几个菌提个质粒验证一下。感觉连接有问题。

好的，又重新做了转化，如果再挑不出来阳性克隆就提质粒酶切，觉得提质粒比较浪费，所以一直是菌落PCR
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12楼2015-01-25 14:25:35
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by still2008 at 2015-01-25 08:41:10
空载吧，觉得是转化的问题。
（以前做的时候都懒，菌液不经沸水处理，从摇床上取下直接作模板。）

我每次是煮沸5min，这次是直接挑的菌落，不知结果会怎样
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13楼2015-01-25 14:26:58
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上官尹悠

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
太长的菌落 pcr 就扩增不出来  你可以做个对照  确保你的引物和操作没有问题

[ 发自小木虫客户端 ]
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努力，追求自己的追求！
14楼2015-01-25 14:40:43
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高高高

金虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2015-01-26 20:14:57
我实验室一个也正遇到这种情况……

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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15楼2015-01-25 15:20:24
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
提质粒吧还是，如果后期需要测序的话提质粒也没什么浪费的。挑个菌质粒pcr和菌液pcr都做一下。看看是不是确实是空载。

[ 发自小木虫客户端 ]
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16楼2015-01-25 15:48:20
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zhangtao110

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by still2008 at 2015-01-25 08:41:10
空载吧，觉得是转化的问题。
（以前做的时候都懒，菌液不经沸水处理，从摇床上取下直接作模板。）

还要经过沸水啊，为啥？

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17楼2015-01-25 16:49:20
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still2008

至尊木虫 (著名写手)

破碎世界的守护者
引用回帖:
17楼: Originally posted by zhangtao110 at 2015-01-25 16:49:20
还要经过沸水啊，为啥？
...

是楼主的处理经过100度持续5min。

[ 发自小木虫客户端 ]
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有时一本正经，有时胡言乱语。
18楼2015-01-25 21:48:19
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by zhangtao110 at 2015-01-25 16:49:20
还要经过沸水啊，为啥？
...

我觉得是将质粒暴露出来
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19楼2015-01-26 09:49:53
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 高高高 at 2015-01-25 15:20:24
我实验室一个也正遇到这种情况……

他是怎么办的？
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20楼2015-01-26 09:54:46
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