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angelababy91

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[求助] DNA提纯遇到的问题已有1人参与

本人第一次接触分子实验，现在在做提取菌株的DNA的实验。采用了CTAB法提取菌丝的DNA，操作步骤完全按照CTAB法进行，但是提取DNA之后用loading buffer 跑电泳检测DNA的纯度，发现①电泳图DNA是两条带，这是因为DNA断裂了还是DNA中有杂质呢？
②DNA中的杂质（蛋白质或RNA）该如何去除呢？具体步骤是什么呢？
③如果将提取的DNA保存在-20度冰箱里一周之后，再使用时发现DNA不纯，现在还能加入RNA酶或蛋白酶吗？那么具体加入这两种酶的步骤是什么呢？
④DNA的OD260/280的值在1.8-2.0之间时，跑ITS-PCR后电泳发现条带不太清纯，有些有拖尾现象，有些隐约是两条带，这又是为什么呢？

我做了两个月的实验了，但是还是找不到解决DNA纯度的办法，恳请各位大师帮我解决这四个问题，感激不尽啊！！！

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1楼2015-01-05 16:08:24

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kuaile5420

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【答案】应助回帖

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angelababy91(kx444555代发): 金币+5, 鼓励交流 2015-01-07 16:46:59

您好，可以先问一下您提取DNA的目的何在？比如做PCR，还是进行大肠杆菌转化，还是送测速？根据你的目的来确定你DNA样品的纯度要求等。根据你提供的信息，来初步回答你的问题，①电泳图DNA是两条带？提取的是全基因组吗？如果是单纯的质粒或者核DNA理论上应该只有一条带；②DNA中的杂质（蛋白质或RNA）该如何去除呢？添加蛋白酶和RNA酶就可以去除，然后做个纯化就可以收集到很纯的DNA;③如果将提取的DNA保存在-20度冰箱里一周之后，再使用时发现DNA不纯，现在还能加入RNA酶或蛋白酶吗？在存放DNA之前确定其纯度，理论上应该不会再次受到其他杂志影响的呀，还有就是如果DNA没有发生降解，应该可以使用上述的纯化方法的，但是有个问题要注意下反复冻融可能对DNA不好；④DNA的OD260/280的值在1.8-2.0之间时，跑ITS-PCR后电泳发现条带不太清纯，有些有拖尾现象，有些隐约是两条带，这又是为什么呢？这个问题的产生有很多的可能性，比如，引物放久了不好用了，产生了非特异性扩增，或者该PCR体系中的那种物质效果不好了，甚至有可能是操作过程中出现了很低级的错误（例如加酶时没有确定是否把酶都加进去了）。最后，我有个建议，你可以将你提取的菌丝DNA跑胶，做个胶回收，切你想要的条带，这样应该可以达到你的要求。如果还满意的话，给点金币哈，嘿嘿~

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坚持到底就是胜利！

2楼2015-01-05 22:31:26

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angelababy91

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引用回帖:

2楼: Originally posted by kuaile5420 at 2015-01-05 22:31:26
您好，可以先问一下您提取DNA的目的何在？比如做PCR，还是进行大肠杆菌转化，还是送测速？根据你的目的来确定你DNA样品的纯度要求等。根据你提供的信息，来初步回答你的问题，①电泳图DNA是两条带？提取的是全基因组 ...

谢谢你的答复~我提取DNA的目的是要跑PCR来检测菌株的遗传多样性，所以需要DNA纯度很高。①我是用液氮研磨菌丝提取菌丝的DNA，理论上是一根带，但是我为什么跑出来两条带呢？是因为DNA断裂还是有杂质呢？②添加蛋白酶和RNA酶提纯DNA的具体操作步骤是什么呢？添加完这两种酶再纯化，那纯化的具体步骤又是什么呢？③提取完DNA后没有检测其纯度直接放进-20度冰箱保存一周后，再拿出来使用时检测其纯度不高，这个时候再添加蛋白酶和RNA酶还能纯化DNA吗？这两种酶都要放吗？怎样检测这两种酶是否都需要加呢？④我只使用了CTAB法提取DNA没有加任何酶，因为不知道这两种酶怎么加。DNA跑胶回收的具体操作步骤又是什么呢？

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3楼2015-01-06 13:02:00

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