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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 求助土壤总DNA提取和16S rDNA扩增
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xiangchou812

木虫 (小有名气)

[求助] 求助土壤总DNA提取和16S rDNA扩增 已有5人参与

最近在做土壤微生物多样性研究，结果在总DNA提取和pcr扩增上遇到难题。先是买国内生物公司的土壤DNA提取试剂盒，使用固氮菌通用引物PolF和PolR为引物，TAKARA的rTaq酶扩增，结果为阴性，怀疑国内试剂盒不行，遂换用进口MoBio公司强力土壤DNA提取试剂盒，琼脂糖检测条带挺亮，0D260/280也正常，260/230只有1.2左右，但PCR结果还是阴性，后又合成细菌通用引物27F/2492R，直接以DH5a菌液为模板，可以扩出预期大小条带，但以提取到的土壤DNA为模板，又是阴性。有文献说Mg2+浓度被土壤腐殖质等螯合会抑制PCR，故在反应体系中加入土壤DNA和DH5a菌液混合物为模板，却可扩到明亮做条带。怀疑土壤保存方法有问题，又从院子草地里取新鲜土样，提DNA，PCR结果仍是阴性。来回折腾快一个月了，总是原地踏步，实是无语，特求教大神们，问题会在哪里？感激涕零！

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1楼 2014-04-23 22:38:03
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

20093651

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dllchina: 金币+3, good~ 2014-04-24 21:35:47
xiangchou812: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-04-26 11:20:55
首先纠正一下，细菌通用引物是27F/1492R而非2492，我不知道你怎么扩的，DNA条带检测都有，怎么就扩不出来？一般简单的方法是把DNA样品稀释基本都可以解决，或者你直接把DNA纯化之后再来做，不知道你的是什么土样，如果腐殖质含量太高，土样应该先用磷酸缓冲液洗一下再提DNA，就说这么多吧，楼主自己看着办，祝好
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但行好事，莫问前程
3楼2014-04-24 09:29:21
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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xiangchou812: 金币+1, ★有帮助 2014-04-26 11:21:10
应该还是腐殖酸的问题。将dna梯度稀释，扩增pcr。
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4楼2014-04-24 10:04:27
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cx13033236

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xiangchou812 at 2014-04-24 20:50:32
感谢你的建议，PCR时引物浓度应该是多少呢？谢谢！
...

一般按照引物合成公司给你的稀释条件稀释引物后，上下游各加0.5-1微升就可以，你可以加0.5和1微升对比下效果，另外DNA浓度不需要稀释了，不是很高。
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9楼2014-04-25 09:16:50
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lx李欣

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xiangchou812 at 2014-04-24 20:46:21
因为是半道出家来做土壤微生物的，我用的土样是条播的黑麦草根际土，提出来后DNA浓度只有30ng/uL左右，这样还能再稀释吗？您做时模板量用多少呢？
...

我觉得这个浓度应该可以了，我之前P的总DNA就十几二十几ng/uL这样！
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13楼2014-05-04 16:40:16
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普通回帖

lx李欣

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+3, 鼓励新虫应助！ 2014-04-24 08:56:55
xiangchou812: 金币+1, ★有帮助 2014-04-26 11:20:41
总DNA提取出来后，跑电泳有的话，你可以考虑调一下引物的浓度，之前我就是引物浓度太低没有扩出来！
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2楼2014-04-24 08:31:44
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cx13033236

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xiangchou812: 金币+1, ★有帮助 2014-04-26 11:21:20
首先可以考虑将DNA提取过程中腐殖质去除过程重复一遍；然后提取之后测一下DNA浓度，看浓度的高低决定是否需要稀释后再进行PCR过程。
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5楼2014-04-24 10:21:40
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xiangchou812

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 20093651 at 2014-04-24 09:29:21
首先纠正一下，细菌通用引物是27F/1492R而非2492，我不知道你怎么扩的，DNA条带检测都有，怎么就扩不出来？一般简单的方法是把DNA样品稀释基本都可以解决，或者你直接把DNA纯化之后再来做，不知道你的是什么土样，如 ...

因为是半道出家来做土壤微生物的，我用的土样是条播的黑麦草根际土，提出来后DNA浓度只有30ng/uL左右，这样还能再稀释吗？您做时模板量用多少呢？

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6楼2014-04-24 20:46:21
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xiangchou812

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lx李欣 at 2014-04-24 08:31:44
总DNA提取出来后，跑电泳有的话，你可以考虑调一下引物的浓度，之前我就是引物浓度太低没有扩出来！

引物浓度应该用多少呢？请不吝赐教！

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7楼2014-04-24 20:47:48
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xiangchou812

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cx13033236 at 2014-04-24 10:21:40
首先可以考虑将DNA提取过程中腐殖质去除过程重复一遍；然后提取之后测一下DNA浓度，看浓度的高低决定是否需要稀释后再进行PCR过程。

感谢你的建议，PCR时引物浓度应该是多少呢？谢谢！

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8楼2014-04-24 20:50:32
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20093651

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xiangchou812 at 2014-04-24 20:46:21
因为是半道出家来做土壤微生物的，我用的土样是条播的黑麦草根际土，提出来后DNA浓度只有30ng/uL左右，这样还能再稀释吗？您做时模板量用多少呢？
...

嗯，你稀释100倍试试看吧
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但行好事，莫问前程
10楼2014-04-25 10:34:25
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