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xiangchou812

木虫 (小有名气)

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专业: 微生物生态学

[求助] 求助土壤总DNA提取和16S rDNA扩增已有5人参与

最近在做土壤微生物多样性研究，结果在总DNA提取和pcr扩增上遇到难题。先是买国内生物公司的土壤DNA提取试剂盒，使用固氮菌通用引物PolF和PolR为引物，TAKARA的rTaq酶扩增，结果为阴性，怀疑国内试剂盒不行，遂换用进口MoBio公司强力土壤DNA提取试剂盒，琼脂糖检测条带挺亮，0D260/280也正常，260/230只有1.2左右，但PCR结果还是阴性，后又合成细菌通用引物27F/2492R，直接以DH5a菌液为模板，可以扩出预期大小条带，但以提取到的土壤DNA为模板，又是阴性。有文献说Mg2+浓度被土壤腐殖质等螯合会抑制PCR，故在反应体系中加入土壤DNA和DH5a菌液混合物为模板，却可扩到明亮做条带。怀疑土壤保存方法有问题，又从院子草地里取新鲜土样，提DNA，PCR结果仍是阴性。来回折腾快一个月了，总是原地踏步，实是无语，特求教大神们，问题会在哪里？感激涕零！

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1楼2014-04-23 22:38:03

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xiangchou812

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引用回帖:

3楼: Originally posted by 20093651 at 2014-04-24 09:29:21
首先纠正一下，细菌通用引物是27F/1492R而非2492，我不知道你怎么扩的，DNA条带检测都有，怎么就扩不出来？一般简单的方法是把DNA样品稀释基本都可以解决，或者你直接把DNA纯化之后再来做，不知道你的是什么土样，如 ...

因为是半道出家来做土壤微生物的，我用的土样是条播的黑麦草根际土，提出来后DNA浓度只有30ng/uL左右，这样还能再稀释吗？您做时模板量用多少呢？

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