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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重组PCR 扩不出来需要的条带
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jjsh310

金虫 (小有名气)

[求助] 重组PCR 扩不出来需要的条带

总是出现不了需要的条带。杂带很多也很亮。

一个片段是EGFP基因（750bp），另一个片段长2.6kb。两个片段重叠15bp。

各自PCR之后切胶回收测浓度。按照摩尔比1:1加的模板。重组PCR的时候是先进行一轮8个循环的扩增（退火温度50℃），加Phusion酶不加引物。之后加引物进行第二轮扩增，退火温度从50到70的梯度。结果出来就是图片上这样。应该在3.4k左右有条带出现的。

引物一条是34个碱基     另一条60个碱基   

Marker是250bp ladder 从上往下依次是5k  3k  2k  1.5k 1k 750 500 250 100

求赐教。第一次做重组PCR，不太了解哪里出问题了。

重组PCR   扩不出来需要的条带
20141124重组PCR.jpg
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初来乍到··
1楼 2014-11-25 11:06:40
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炼水燎原

新虫 (小有名气)
没法infusion?或者不可以分开装？
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trust is earned
2楼2014-11-26 19:42:10
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 炼水燎原 at 2014-11-26 19:42:10
没法infusion?或者不可以分开装？

Infusion酶还没买回来   想着试试重组PCR   各种组也没组到一起········
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初来乍到··
3楼2014-11-27 18:45:16
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100421

新虫 (初入文坛)
我觉的可能是重叠区的bp数太少了，你再试试看
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4楼2015-01-20 11:13:37
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