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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 蛋白表达 超声破碎问题
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95846713

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白表达 超声破碎问题已有1人参与

本人新手，不知道跑SDS-page时的上清和沉淀具体是哪个？   用（1）（2）（3）（4）中哪2个跑SDS-page？   超声破碎后用不用离心啊？
1.  上清：菌体诱导再离心后的上清（1），   沉淀：菌体离心后沉淀， 再用PBS悬浮，再超声波破碎（2）
2.菌体离心后，PBS重悬，超声波破碎破碎，离心后的上清（3） 和沉淀（4）
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1楼2014-11-19 10:06:19
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youlinglyw

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一匡天下

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
95846713(myprayer代发): 金币+5, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-19 11:34:20
一般情况下
跑1 的目的是为了检测你的蛋白是否除了包涵体外，还有可溶部分表达。如果可溶部分表达多的话，那么说不定有活性或者需要收集。毕竟表达不易。不过大部分原核表达都是包涵体了，因为表达速度快，再加上缺乏必要的酶去折叠修饰
跑2的目的，这个一般是用来和1做对比的。证明你的蛋白是在包涵体表达，而不是上清表达。
以上为一栏。可以并列跑，做对比。
跑3的目的是为了检测你的包涵体在超声破碎后已经重新溶解在pbs中，
跑4的目的是为了检测你的包涵体在超声破碎后，依然没有溶解在pbs中，那么你需要用尿素之类的溶解过夜去把蛋白提取出来。
以上为一栏，可以并列跑，作对比，来防止有的蛋白非常容易溶解，你辛辛苦苦把包涵体拿出来，尿素溶解后，却发现，没东西，人家早就溶解到了上清了（这个比较罕见哈，也不排除，生物嘛，没有例外还叫生物啊）
这4个都是有必要跑的。
其中1,2是必须跑得，用来最初证明包涵体表达。在发文章也会用到，而3,4则是用来做方便实验的。
因为蛋白的种类多，条件也复杂。等电点等稍微的差异都会造成溶解不一样。

如果非说要跑的话，2,4是必须跑，事实上，1,2,4都是常见的。而很多人会选择1,2,3,4都跑胶，这样，证据鲜明，对照明显，有说服力。
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天行健
2楼2014-11-19 10:16:39
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youlinglyw

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一匡天下

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【答案】应助回帖

补充说明
之所以说1,2是必须的，是因为你要告诉对方、
a，我已经成功进行了蛋白表达
b，我表达的蛋白大小是我需要的
c，我表达的蛋白其量是足够我进行下一步操作的，如果在1,2的电泳时候，你发现表达量不够，那么后续根本没必要做。必须优化条件，换菌株，换载体，甚至换片段来获取更高的表达量。蛋白的纯化是非常损耗的，一般能得到20%左右都算很高很高了。
d，我表达的蛋白是存在于包涵体，因此，接下来可以毫无疑问，我的蛋白是缺乏活性的。如果你要做的是有活性的蛋白，那么就要悠着点了，很多时候，用酵母表达，表达蛋白需存在于上清，才有活性。包涵体是没活性的。
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天行健
3楼2014-11-19 10:22:12
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95846713

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-11-19 10:22:12
补充说明
之所以说1,2是必须的，是因为你要告诉对方、
a，我已经成功进行了蛋白表达
b，我表达的蛋白大小是我需要的
c，我表达的蛋白其量是足够我进行下一步操作的，如果在1,2的电泳时候，你发现表达量不够，那 ...

谢谢 解释的太透彻了
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4楼2014-11-19 10:27:06
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