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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » PET28a连接问题
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

[求助] PET28a连接问题 已有3人参与

T4连接酶，6u目的片段（胶回收浓度偏低，30左右），2u载体，1u酶，1ulBuffer，16度连接过夜，板上干干净净，什么都没长。怎么回事？
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踏实
1楼 2014-11-05 10:28:16
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

caihang

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-05 22:27:42
为什么空载体都没有...

没有就是对的，你酶切之后载体两端带不同的粘性末端，连接酶不能将它们连上，所以没有空载体。
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11楼2014-11-06 10:02:00
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普通回帖

caihang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-05 14:23:27
没长菌也不一定没有价值，起码可以说明，质粒是切开了的。建议：1，提高目的片段的浓度；2，多做几组比例的连接。祝试验顺利。
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2楼2014-11-05 12:14:50
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by caihang at 2014-11-05 12:14:50
没长菌也不一定没有价值，起码可以说明，质粒是切开了的。建议：1，提高目的片段的浓度；2，多做几组比例的连接。祝试验顺利。

目的片段200ng左右，我有个疑问，pcr产物用酶切吗
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踏实
3楼2014-11-05 14:09:43
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圆yy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-06 20:36:06
1、PCR产物不一定能扩增出你的目的酶切位点
2、pcr产物先连克隆载体再切，胶回收（低温核酸易结合于硅胶模上，高温易分离）
3、目的基因和载体的浓度比大一点，10:1的体积都可以
4、转化的时候，注意热击时间不要过长，1min，42°够了，前后要冰浴
5、你的问题是连载体都没有转进去，所以你转化出问题了，自己作对照机会分析原因啦
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4楼2014-11-05 14:53:31
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korchagin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-06 20:36:14
PCR产物当然要酶切了，如果你没有进行酶切，那么连不上是正常的
PCR产物可以连接到T载上然后再切，也可以不连，不连的话需要设计保护基团
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5楼2014-11-05 15:21:25
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 圆yy at 2014-11-05 14:53:31
1、PCR产物不一定能扩增出你的目的酶切位点
2、pcr产物先连克隆载体再切，胶回收（低温核酸易结合于硅胶模上，高温易分离）
3、目的基因和载体的浓度比大一点，10:1的体积都可以
4、转化的时候，注意热击时间不要 ...

之前连t载测序正确的，以它没模版pcr不带信号肽的序列，然后回收，酶切，过柱回收，连接，有问题吗？大神帮忙看看

[ 发自小木虫客户端 ]
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踏实
6楼2014-11-05 19:30:11
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xy656691

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-05 19:30:11
之前连t载测序正确的，以它没模版pcr不带信号肽的序列，然后回收，酶切，过柱回收，连接，有问题吗？大神帮忙看看
...

没问题，就这样做吧
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7楼2014-11-05 20:37:12
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caihang

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 圆yy at 2014-11-05 14:53:31
1、PCR产物不一定能扩增出你的目的酶切位点
2、pcr产物先连克隆载体再切，胶回收（低温核酸易结合于硅胶模上，高温易分离）
3、目的基因和载体的浓度比大一点，10:1的体积都可以
4、转化的时候，注意热击时间不要 ...

有些疑问，1PCR产物不一定能扩出目的酶切位点是什么意思，酶切位点都是引物上的，PCR肯定是能扩出来的。2你说问题是连载体都没有转进去，这个怎么理解？
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8楼2014-11-05 20:55:20
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xy656691 at 2014-11-05 20:37:12
没问题，就这样做吧...

恩恩，谢谢版主，研一没人带我做实验，总是上课，研二刚开始做实验，带我们的师姐就出国了，两年，很谢谢版主的帮助。
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踏实
9楼2014-11-05 22:01:17
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by caihang at 2014-11-05 12:14:50
没长菌也不一定没有价值，起码可以说明，质粒是切开了的。建议：1，提高目的片段的浓度；2，多做几组比例的连接。祝试验顺利。

为什么空载体都没有
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踏实
10楼2014-11-05 22:27:42
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