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hajierlove

铜虫 (正式写手)

[求助] PET28a连接问题 已有3人参与

T4连接酶,6u目的片段(胶回收浓度偏低,30左右),2u载体,1u酶,1ulBuffer,16度连接过夜,板上干干净净,什么都没长。怎么回事?
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踏实
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圆yy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-06 20:36:06
1、PCR产物不一定能扩增出你的目的酶切位点
2、pcr产物先连克隆载体再切,胶回收(低温核酸易结合于硅胶模上,高温易分离)
3、目的基因和载体的浓度比大一点,10:1的体积都可以
4、转化的时候,注意热击时间不要过长,1min,42°够了,前后要冰浴
5、你的问题是连载体都没有转进去,所以你转化出问题了,自己作对照机会分析原因啦
4楼2014-11-05 14:53:31
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caihang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-05 14:23:27
没长菌也不一定没有价值,起码可以说明,质粒是切开了的。建议:1,提高目的片段的浓度;2,多做几组比例的连接。祝试验顺利。
2楼2014-11-05 12:14:50
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by caihang at 2014-11-05 12:14:50
没长菌也不一定没有价值,起码可以说明,质粒是切开了的。建议:1,提高目的片段的浓度;2,多做几组比例的连接。祝试验顺利。

目的片段200ng左右,我有个疑问,pcr产物用酶切吗
踏实
3楼2014-11-05 14:09:43
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korchagin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


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hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-06 20:36:14
PCR产物当然要酶切了,如果你没有进行酶切,那么连不上是正常的
PCR产物可以连接到T载上然后再切,也可以不连,不连的话需要设计保护基团
5楼2014-11-05 15:21:25
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