应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » Gateway构建载体BP反应涂平板长不出单菌落
151/2返回列表12下一页
查看: 4446  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

okletsgo

新虫 (初入文坛)

[求助] Gateway构建载体BP反应涂平板长不出单菌落 已有5人参与

最近在用Gateway方法构建载体，目的片段再300-1000bp不等，要构建好几个载体，同时做BP反应后涂平板，有的能长出单菌落，有的长不出来，而且LR反应正常而且转化效率很高，长不出的那几个载体反复做了好几次，BP酶也换过新的了，抗生素浓度也减半了，还是涂平板长不出单菌落，求解！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-10-22 10:22:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-23 12:33:22
1 是否使用了正确可抗性平板
2 加入BP反应的DNA浓度是否足够，我自己的体系是PCR产物1微升（大于80 ng/ul），载体1微升（大于100 ng/ul），BP 0.5微升，混匀室温3 h转入TOP 10
赞一下 回复此楼
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2014-10-22 14:20:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2014-10-22 14:20:19
1 是否使用了正确可抗性平板
2 加入BP反应的DNA浓度是否足够，我自己的体系是PCR产物1微升（大于80 ng/ul），载体1微升（大于100 ng/ul），BP 0.5微升，混匀室温3 h转入TOP 10

我是PCR产物150ng，载体50ng，BP 1微升，25℃过夜连接
赞一下 回复此楼
3楼2014-10-22 14:56:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大笨熊敏

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
okletsgo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 21:07:25
你看过Gateway构建载体的那篇说明书了没有的。它上面介绍说目的产物和载体大约都在150ng左右，我做BP反应一般只反应10h，时间太长好像也会有影响。
赞一下 回复此楼
4楼2014-10-22 20:47:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 大笨熊敏 at 2014-10-22 20:47:06
你看过Gateway构建载体的那篇说明书了没有的。它上面介绍说目的产物和载体大约都在150ng左右，我做BP反应一般只反应10h，时间太长好像也会有影响。

:;恩，我换一个体系试一下
赞一下 回复此楼
5楼2014-10-22 21:29:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 大笨熊敏 at 2014-10-22 20:47:06
你看过Gateway构建载体的那篇说明书了没有的。它上面介绍说目的产物和载体大约都在150ng左右，我做BP反应一般只反应10h，时间太长好像也会有影响。

但是我用相同 的体系做LR反应效率就很高，BP反应就出不来
赞一下 回复此楼
6楼2014-10-22 21:31:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR引物设计对了没？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
7楼2014-10-23 07:19:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sunshine436 at 2014-10-23 07:19:37
PCR引物设计对了没？

这个应该没问题，PCR目的条带是对的，而且我有的载体构建出来了，有的就构建不出来
赞一下 回复此楼
8楼2014-10-23 10:00:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by okletsgo at 2014-10-23 10:00:01
这个应该没问题，PCR目的条带是对的，而且我有的载体构建出来了，有的就构建不出来...

别的构建也是做BP都成功了？用的供体载体，感受态，平板都一样？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
9楼2014-10-23 13:05:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
okletsgo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-18 18:16:58
做BP目的基因在20~150ng之间，加载体1微升，酶1微升，TE Buffer 1微升，>=5小时，转化后先在100微升培养液（不加抗生素）中扩1小时，再凃板。
赞一下 回复此楼
10楼2014-10-24 23:02:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 okletsgo 的主题更新
151/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 5/250 2026-08-23 04:07 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 4/200 2026-08-23 04:04 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:55 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 03:52 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 11/550 2026-08-23 02:55 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +3 zjuhero 2026-08-22 4/200 2026-08-22 20:02 by mycsru
[基金申请] 什么时候开奖？ +7 CrisMessi 2026-08-18 8/400 2026-08-22 18:29 by 淀粉搬运工
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +10 kulium 2026-08-21 13/650 2026-08-21 21:58 by alongwaytogo
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +11 大萍1987 2026-08-20 13/650 2026-08-21 14:48 by 20120902066
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭