应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » Gateway构建载体BP反应涂平板长不出单菌落
151/2返回列表12下一页
查看: 4120  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

okletsgo

新虫 (初入文坛)

[求助] Gateway构建载体BP反应涂平板长不出单菌落 已有5人参与

最近在用Gateway方法构建载体，目的片段再300-1000bp不等，要构建好几个载体，同时做BP反应后涂平板，有的能长出单菌落，有的长不出来，而且LR反应正常而且转化效率很高，长不出的那几个载体反复做了好几次，BP酶也换过新的了，抗生素浓度也减半了，还是涂平板长不出单菌落，求解！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-10-22 10:22:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-23 12:33:22
1 是否使用了正确可抗性平板
2 加入BP反应的DNA浓度是否足够，我自己的体系是PCR产物1微升（大于80 ng/ul），载体1微升（大于100 ng/ul），BP 0.5微升，混匀室温3 h转入TOP 10
赞一下 回复此楼
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2014-10-22 14:20:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2014-10-22 14:20:19
1 是否使用了正确可抗性平板
2 加入BP反应的DNA浓度是否足够，我自己的体系是PCR产物1微升（大于80 ng/ul），载体1微升（大于100 ng/ul），BP 0.5微升，混匀室温3 h转入TOP 10

我是PCR产物150ng，载体50ng，BP 1微升，25℃过夜连接
赞一下 回复此楼
3楼2014-10-22 14:56:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大笨熊敏

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
okletsgo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 21:07:25
你看过Gateway构建载体的那篇说明书了没有的。它上面介绍说目的产物和载体大约都在150ng左右，我做BP反应一般只反应10h，时间太长好像也会有影响。
赞一下 回复此楼
4楼2014-10-22 20:47:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 大笨熊敏 at 2014-10-22 20:47:06
你看过Gateway构建载体的那篇说明书了没有的。它上面介绍说目的产物和载体大约都在150ng左右，我做BP反应一般只反应10h，时间太长好像也会有影响。

:;恩，我换一个体系试一下
赞一下 回复此楼
5楼2014-10-22 21:29:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 大笨熊敏 at 2014-10-22 20:47:06
你看过Gateway构建载体的那篇说明书了没有的。它上面介绍说目的产物和载体大约都在150ng左右，我做BP反应一般只反应10h，时间太长好像也会有影响。

但是我用相同 的体系做LR反应效率就很高，BP反应就出不来
赞一下 回复此楼
6楼2014-10-22 21:31:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR引物设计对了没？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
7楼2014-10-23 07:19:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sunshine436 at 2014-10-23 07:19:37
PCR引物设计对了没？

这个应该没问题，PCR目的条带是对的，而且我有的载体构建出来了，有的就构建不出来
赞一下 回复此楼
8楼2014-10-23 10:00:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by okletsgo at 2014-10-23 10:00:01
这个应该没问题，PCR目的条带是对的，而且我有的载体构建出来了，有的就构建不出来...

别的构建也是做BP都成功了？用的供体载体，感受态，平板都一样？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
9楼2014-10-23 13:05:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
okletsgo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-18 18:16:58
做BP目的基因在20~150ng之间，加载体1微升，酶1微升，TE Buffer 1微升，>=5小时，转化后先在100微升培养液（不加抗生素）中扩1小时，再凃板。
赞一下 回复此楼
10楼2014-10-24 23:02:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 okletsgo 的主题更新
151/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 304求调剂 +5 素年祭语 2026-03-15 5/250 2026-03-16 17:00 by 我的船我的海
[考研] 268求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-14 6/300 2026-03-14 22:20 by 运气yunqi
[考研] 复试调剂 +3 呼呼？~+123456 2026-03-14 3/150 2026-03-14 16:53 by WTUChen
[考研] 297求调剂 +4 学海漂泊 2026-03-13 4/200 2026-03-14 11:51 by 热情沙漠
[考研] 26考研调剂 +3 ying123. 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:18 by JourneyLucky
[考研] 0805，333求调剂 +3 112253525 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:42 by JourneyLucky
[考研] 材料371求调剂 +9 鳄鱼? 2026-03-11 11/550 2026-03-13 22:53 by JourneyLucky
[考研] 材料专硕288分求调剂 一志愿211 +4 在家想你 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:49 by JourneyLucky
[考研] 332求调剂 +3 zjy101327 2026-03-11 6/300 2026-03-13 22:48 by JourneyLucky
[考研] 求调剂（材料与化工327） +4 爱吃香菜啦 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:11 by JourneyLucky
[硕博家园] 085600 260分求调剂 +3 天空还下雨么 2026-03-13 5/250 2026-03-13 18:46 by 天空还下雨么
[考研] 0703化学求调剂 +7 绿豆芹菜汤 2026-03-12 7/350 2026-03-13 17:25 by njzyff
[考研] 求调剂 +7 18880831720 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:10 by JourneyLucky
[考研] 307求调剂 +5 超级伊昂大王 2026-03-12 5/250 2026-03-13 15:56 by 棒棒球手
[考研] 290求调剂 +7 ADT 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:17 by JourneyLucky
[考研] 材料301分求调剂 +5 Liyouyumairs 2026-03-12 5/250 2026-03-13 14:42 by JourneyLucky
[考研] 274求调剂0856材料化工 +12 z2839474511 2026-03-11 13/650 2026-03-13 10:39 by peike
[考研] 279求调剂 +3 莫xiao 2026-03-10 4/200 2026-03-11 08:06 by 斩魂滴兔子！
[考研] 哈工大材料324求调剂 +6 闫旭东 2026-03-10 8/400 2026-03-10 22:49 by 星空星月
[考研] 化工0817调剂 +8 灿若星晨 2026-03-10 8/400 2026-03-10 22:44 by 星空星月
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭