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okletsgo

新虫 (初入文坛)

[求助] Gateway构建载体BP反应涂平板长不出单菌落 已有5人参与

最近在用Gateway方法构建载体,目的片段再300-1000bp不等,要构建好几个载体,同时做BP反应后涂平板,有的能长出单菌落,有的长不出来,而且LR反应正常而且转化效率很高,长不出的那几个载体反复做了好几次,BP酶也换过新的了,抗生素浓度也减半了,还是涂平板长不出单菌落,求解!
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-23 12:33:22
1 是否使用了正确可抗性平板
2 加入BP反应的DNA浓度是否足够,我自己的体系是PCR产物1微升(大于80 ng/ul),载体1微升(大于100 ng/ul),BP 0.5微升,混匀室温3 h转入TOP 10
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
2楼2014-10-22 14:20:19
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okletsgo

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2014-10-22 14:20:19
1 是否使用了正确可抗性平板
2 加入BP反应的DNA浓度是否足够,我自己的体系是PCR产物1微升(大于80 ng/ul),载体1微升(大于100 ng/ul),BP 0.5微升,混匀室温3 h转入TOP 10

我是PCR产物150ng,载体50ng,BP 1微升,25℃过夜连接
3楼2014-10-22 14:56:07
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大笨熊敏

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
okletsgo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 21:07:25
你看过Gateway构建载体的那篇说明书了没有的。它上面介绍说目的产物和载体大约都在150ng左右,我做BP反应一般只反应10h,时间太长好像也会有影响。
4楼2014-10-22 20:47:06
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okletsgo

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 大笨熊敏 at 2014-10-22 20:47:06
你看过Gateway构建载体的那篇说明书了没有的。它上面介绍说目的产物和载体大约都在150ng左右,我做BP反应一般只反应10h,时间太长好像也会有影响。

:;恩,我换一个体系试一下
5楼2014-10-22 21:29:32
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okletsgo

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 大笨熊敏 at 2014-10-22 20:47:06
你看过Gateway构建载体的那篇说明书了没有的。它上面介绍说目的产物和载体大约都在150ng左右,我做BP反应一般只反应10h,时间太长好像也会有影响。

但是我用相同 的体系做LR反应效率就很高,BP反应就出不来
6楼2014-10-22 21:31:02
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sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR引物设计对了没?

[ 发自小木虫客户端 ]
7楼2014-10-23 07:19:37
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okletsgo

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by sunshine436 at 2014-10-23 07:19:37
PCR引物设计对了没?

这个应该没问题,PCR目的条带是对的,而且我有的载体构建出来了,有的就构建不出来
8楼2014-10-23 10:00:01
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sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by okletsgo at 2014-10-23 10:00:01
这个应该没问题,PCR目的条带是对的,而且我有的载体构建出来了,有的就构建不出来...

别的构建也是做BP都成功了?用的供体载体,感受态,平板都一样?

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2014-10-23 13:05:44
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天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


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okletsgo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-18 18:16:58
做BP目的基因在20~150ng之间,加载体1微升,酶1微升,TE Buffer 1微升,>=5小时,转化后先在100微升培养液(不加抗生素)中扩1小时,再凃板。
10楼2014-10-24 23:02:46
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