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okletsgo

新虫 (初入文坛)

[求助] Gateway构建载体BP反应涂平板长不出单菌落 已有5人参与

最近在用Gateway方法构建载体，目的片段再300-1000bp不等，要构建好几个载体，同时做BP反应后涂平板，有的能长出单菌落，有的长不出来，而且LR反应正常而且转化效率很高，长不出的那几个载体反复做了好几次，BP酶也换过新的了，抗生素浓度也减半了，还是涂平板长不出单菌落，求解！
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1楼 2014-10-22 10:22:55
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-23 12:33:22
1 是否使用了正确可抗性平板
2 加入BP反应的DNA浓度是否足够，我自己的体系是PCR产物1微升（大于80 ng/ul），载体1微升（大于100 ng/ul），BP 0.5微升，混匀室温3 h转入TOP 10
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2014-10-22 14:20:19
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okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2014-10-22 14:20:19
1 是否使用了正确可抗性平板
2 加入BP反应的DNA浓度是否足够，我自己的体系是PCR产物1微升（大于80 ng/ul），载体1微升（大于100 ng/ul），BP 0.5微升，混匀室温3 h转入TOP 10

我是PCR产物150ng，载体50ng，BP 1微升，25℃过夜连接
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3楼2014-10-22 14:56:07
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大笨熊敏

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
okletsgo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 21:07:25
你看过Gateway构建载体的那篇说明书了没有的。它上面介绍说目的产物和载体大约都在150ng左右，我做BP反应一般只反应10h，时间太长好像也会有影响。
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4楼2014-10-22 20:47:06
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okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 大笨熊敏 at 2014-10-22 20:47:06
你看过Gateway构建载体的那篇说明书了没有的。它上面介绍说目的产物和载体大约都在150ng左右，我做BP反应一般只反应10h，时间太长好像也会有影响。

:;恩，我换一个体系试一下
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5楼2014-10-22 21:29:32
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okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 大笨熊敏 at 2014-10-22 20:47:06
你看过Gateway构建载体的那篇说明书了没有的。它上面介绍说目的产物和载体大约都在150ng左右，我做BP反应一般只反应10h，时间太长好像也会有影响。

但是我用相同 的体系做LR反应效率就很高，BP反应就出不来
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6楼2014-10-22 21:31:02
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sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR引物设计对了没？

[ 发自小木虫客户端 ]
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7楼2014-10-23 07:19:37
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okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sunshine436 at 2014-10-23 07:19:37
PCR引物设计对了没？

这个应该没问题，PCR目的条带是对的，而且我有的载体构建出来了，有的就构建不出来
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8楼2014-10-23 10:00:01
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sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by okletsgo at 2014-10-23 10:00:01
这个应该没问题，PCR目的条带是对的，而且我有的载体构建出来了，有的就构建不出来...

别的构建也是做BP都成功了？用的供体载体，感受态，平板都一样？

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2014-10-23 13:05:44
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天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
okletsgo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-18 18:16:58
做BP目的基因在20~150ng之间，加载体1微升，酶1微升，TE Buffer 1微升，>=5小时，转化后先在100微升培养液（不加抗生素）中扩1小时，再凃板。
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10楼2014-10-24 23:02:46
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