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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » gateway BP反应涂板没有菌长出来
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lesirenuse

新虫 (初入文坛)

[求助] gateway BP反应涂板没有菌长出来 已有1人参与

最近在做gateway，有一个入门载体已经测序正确了。之后LR反应，涂板后有两个单克隆，都是假阳性的。之后再涂板，就没有菌长出来了。
另外两个BP反应后涂板，也没有菌长出来。片段都在2k以下。确定抗性没有弄错
求大神相助，折腾了一周了。
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1楼 2013-08-22 10:29:36
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare: 金币+2, 应助指数+1, 谢谢分享 2013-10-21 08:22:36
引用回帖:
7楼: Originally posted by litterone123 at 2013-10-19 23:12:08
我最近也要做gateway。麻烦谁有相关资料发一些给我。急等，太感谢了。

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4409532
见我发的资料，其中两个是gateway的说明书
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
8楼2013-10-20 01:11:54
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普通回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-10-20 02:56:22
entry clone在做LR反应前最好进行PEG纯化，否则反应效率太低。正常LR反应应保证EC和vector都在100 ng以上，一切顺利，估计可以长出成百上千个菌落。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

lesirenuse
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2013-08-22 21:19:31
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lesirenuse

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-08-22 21:19:31
entry clone在做LR反应前最好进行PEG纯化，否则反应效率太低。正常LR反应应保证EC和vector都在100 ng以上，一切顺利，估计可以长出成百上千个菌落。

我是把LR反应的产物纯化了,还是没有东西出来
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3楼2013-08-23 18:11:03
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lesirenuse(silicare代发): 金币+5, 谢谢参与 2013-10-21 08:21:55
没那么玄乎哈，我们做BP的时候直接将PCR加入到反应体系中都能出来，LR的时候直接用kit提取的载体，就能搞定，而且我们每个反应都是只加1微升的酶。根据我的经验，做gateway的时候关键是浓度问题，尤其是PCR产物or pZEO，可以低点，但千万别高，Good luck！
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互助互励，共奋共进！！
4楼2013-08-23 22:27:11
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lesirenuse

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-23 22:27:11
没那么玄乎哈，我们做BP的时候直接将PCR加入到反应体系中都能出来，LR的时候直接用kit提取的载体，就能搞定，而且我们每个反应都是只加1微升的酶。根据我的经验，做gateway的时候关键是浓度问题，尤其是PCR产物or p ...

试了不同浓度配比 有时候能长菌 大多数时候不能 可都是假阳性
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5楼2013-08-25 10:51:00
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xingkong0660

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lesirenuse(silicare代发): 金币+2, 谢谢分享 2013-10-21 08:22:23
也遇到同样问题，只是在221时可以长出来，换成干涉的表达载体就长不出了
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6楼2013-09-04 09:34:27
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litterone123

新虫 (初入文坛)
我最近也要做gateway。麻烦谁有相关资料发一些给我。急等，太感谢了。
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7楼2013-10-19 23:12:08
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litterone123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by starseacow at 2013-10-20 01:11:54
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4409532
见我发的资料，其中两个是gateway的说明书...

非常感谢
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9楼2013-10-20 21:57:18
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天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1、BP之后的浓度是多少，浓度最好大于100，表达载体的浓度也最好大于100.
2、最好注意下BP之后提出质粒的纯度1.8～2.0。
3、在做提取和转化的时候，耗材最好用进口的。我们试过用国产EP管做不出来，后来改用进口的EP管就OK了，很有可能是国产EP管用的塑料材料中对质粒有毒性。
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10楼2015-03-11 16:59:45
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