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lesirenuse

新虫 (初入文坛)

[求助] gateway BP反应涂板没有菌长出来已有1人参与

最近在做gateway,有一个入门载体已经测序正确了。之后LR反应,涂板后有两个单克隆,都是假阳性的。之后再涂板,就没有菌长出来了。
另外两个BP反应后涂板,也没有菌长出来。片段都在2k以下。确定抗性没有弄错
求大神相助,折腾了一周了。
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

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★ ★
silicare: 金币+2, 应助指数+1, 谢谢分享 2013-10-21 08:22:36
引用回帖:
7楼: Originally posted by litterone123 at 2013-10-19 23:12:08
我最近也要做gateway。麻烦谁有相关资料发一些给我。急等,太感谢了。

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4409532
见我发的资料,其中两个是gateway的说明书
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
8楼2013-10-20 01:11:54
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流,共同进步~~ 2013-10-20 02:56:22
entry clone在做LR反应前最好进行PEG纯化,否则反应效率太低。正常LR反应应保证EC和vector都在100 ng以上,一切顺利,估计可以长出成百上千个菌落。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
2楼2013-08-22 21:19:31
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lesirenuse

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-08-22 21:19:31
entry clone在做LR反应前最好进行PEG纯化,否则反应效率太低。正常LR反应应保证EC和vector都在100 ng以上,一切顺利,估计可以长出成百上千个菌落。

我是把LR反应的产物纯化了,还是没有东西出来
3楼2013-08-23 18:11:03
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lesirenuse(silicare代发): 金币+5, 谢谢参与 2013-10-21 08:21:55
没那么玄乎哈,我们做BP的时候直接将PCR加入到反应体系中都能出来,LR的时候直接用kit提取的载体,就能搞定,而且我们每个反应都是只加1微升的酶。根据我的经验,做gateway的时候关键是浓度问题,尤其是PCR产物or pZEO,可以低点,但千万别高,Good luck!
互助互励,共奋共进!!
4楼2013-08-23 22:27:11
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lesirenuse

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-23 22:27:11
没那么玄乎哈,我们做BP的时候直接将PCR加入到反应体系中都能出来,LR的时候直接用kit提取的载体,就能搞定,而且我们每个反应都是只加1微升的酶。根据我的经验,做gateway的时候关键是浓度问题,尤其是PCR产物or p ...

试了不同浓度配比 有时候能长菌 大多数时候不能 可都是假阳性
5楼2013-08-25 10:51:00
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xingkong0660

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lesirenuse(silicare代发): 金币+2, 谢谢分享 2013-10-21 08:22:23
也遇到同样问题,只是在221时可以长出来,换成干涉的表达载体就长不出了
6楼2013-09-04 09:34:27
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litterone123

新虫 (初入文坛)

我最近也要做gateway。麻烦谁有相关资料发一些给我。急等,太感谢了。
7楼2013-10-19 23:12:08
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litterone123

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by starseacow at 2013-10-20 01:11:54
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4409532
见我发的资料,其中两个是gateway的说明书...

非常感谢
9楼2013-10-20 21:57:18
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天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1、BP之后的浓度是多少,浓度最好大于100,表达载体的浓度也最好大于100.
2、最好注意下BP之后提出质粒的纯度1.8~2.0。
3、在做提取和转化的时候,耗材最好用进口的。我们试过用国产EP管做不出来,后来改用进口的EP管就OK了,很有可能是国产EP管用的塑料材料中对质粒有毒性。
10楼2015-03-11 16:59:45
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