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luchao507

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1楼 2014-08-28 12:06:10
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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luchao507: 金币+2 2014-08-28 13:36:07
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-28 21:24:55
同意楼上，看了你前一个帖子，你目的片段加1ul我感觉连不上的，1500bp连2700多bp的PMD19不像几百bp的那么好连接，你需要算一算摩尔比才能做。如果你载体加1ul的话相当于50ng载体，那么根据片段：载体3:1来算的话应该要加84ng的胶回收的片段进去。
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。
3楼2014-08-28 12:37:56
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luchao507

禁虫 (小有名气)
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4楼2014-08-28 13:32:13
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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luchao507: 金币+3 2014-08-28 13:32:51
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-28 21:25:03
有两种可能:
             1 你的感受态细胞有问题,可以转抗氨苄质粒作为对照,如果转质粒都没有长,那么感受态出问题了,如果长了,说明感受态没有问题.
            2  感受态细胞没问题的话,那就极有可能是你连接没做好,需要重新连接.
转化方法没问题,一般出不来基本上是上面的问题,楼主每次做实验时,最好做对照,不然出问题不知道哪里有问题.祝实验顺利!
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2楼2014-08-28 12:15:59
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luchao507

禁虫 (小有名气)
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5楼2014-08-28 13:35:30
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huyan0817

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luchao507 at 2014-08-28 13:35:30
你好 我的连接体系是载体1:4目的基因 5的sloution ；16度连接2小时，以前是16度16小时 后来别人建议不要太长时间按说明书的做；我选择了2小时 ；我这样做合适吗？ 是不是没连接上也会有空载体转化进去的？...

16度连接过夜吧!sloution 1 一般就8小时左右哈!2小时有点短! 空载体也要能成环才行啊!不然也很难转进去!
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6楼2014-08-28 13:43:12
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luchao507

禁虫 (小有名气)
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7楼2014-08-28 15:39:28
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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luchao507(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-28 18:03:53
需要验证一下感受态细胞的敏感性，看看连接产物是否能够转化到感受态细胞中，建议做一个阳性对照，采用PUC19质粒直接做转化，看看能不能再氨卞的蓝白斑LB培养基上长出蓝色菌斑，如果能够长出，说明感受态的适用于转化，如果不生长就是感受态的问题了。
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rainwater
8楼2014-08-28 15:56:19
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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luchao507(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-28 18:04:05
如果你用试剂盒做不出来，就只用它的T载，酶直接用T4连接酶和BUFFER。
前提是感受态没问题。
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9楼2014-08-28 16:07:04
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怎么都行

银虫 (小有名气)
弱弱问楼主一句，你不是用高保真酶（末端不带A）扩增的吧？
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10楼2014-08-28 19:03:11
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