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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » PCR产物连接T载体涂板不长菌落
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qauzgd

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物连接T载体涂板不长菌落 已有1人参与

首先，用1000+的PCR片段（纯化，没有做胶回收）按说明书操作连接PEASY-1以及18t载体，然后涂板子37度过夜。。。一个斑都没有。 用的TAQ酶，确认加A。
然后，第二天把涂板剩下的菌液（4度保存的）摇菌2h再涂板子，均匀的蓝白斑，但是白斑用M13通用引物做菌液PCR，结果全是空载体和二聚体的小片段。
这个问题快半个月了，求大侠们指点！谢谢！
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1楼 2014-10-06 22:35:42
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qapollo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-07 12:23:55
连接时间保证在20分钟之内，另外直接用TAQ加A也不是很稳定，实在不行就换平末端试剂盒。你说的细节太少，我只能说这么多。
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2楼2014-10-07 01:02:11
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qauzgd

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by qapollo at 2014-10-07 01:02:11
连接时间保证在20分钟之内，另外直接用TAQ加A也不是很稳定，实在不行就换平末端试剂盒。你说的细节太少，我只能说这么多。

谢谢，不过EASY载体连的15min,18T半小时和两小时都试过的。
其实我最想不明白的是为什么第一次都不长斑，难道是转化的效率不高，然后剩下的菌液4度过夜，载体又自己转进去了吗？！
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3楼2014-10-07 10:48:03
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qauzgd

铁虫 (初入文坛)
大家帮忙看看，会不会是转化的问题啊。。。谢谢
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4楼2014-10-07 14:16:01
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