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qauzgd

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物连接T载体涂板不长菌落 已有1人参与

首先,用1000+的PCR片段(纯化,没有做胶回收)按说明书操作连接PEASY-1以及18t载体,然后涂板子37度过夜。。。一个斑都没有。 用的TAQ酶,确认加A。
然后,第二天把涂板剩下的菌液(4度保存的)摇菌2h再涂板子,均匀的蓝白斑,但是白斑用M13通用引物做菌液PCR,结果全是空载体和二聚体的小片段。
这个问题快半个月了,求大侠们指点!谢谢!
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qapollo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-10-07 12:23:55
连接时间保证在20分钟之内,另外直接用TAQ加A也不是很稳定,实在不行就换平末端试剂盒。你说的细节太少,我只能说这么多。
2楼2014-10-07 01:02:11
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qauzgd

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by qapollo at 2014-10-07 01:02:11
连接时间保证在20分钟之内,另外直接用TAQ加A也不是很稳定,实在不行就换平末端试剂盒。你说的细节太少,我只能说这么多。

谢谢,不过EASY载体连的15min,18T半小时和两小时都试过的。
其实我最想不明白的是为什么第一次都不长斑,难道是转化的效率不高,然后剩下的菌液4度过夜,载体又自己转进去了吗?!
3楼2014-10-07 10:48:03
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qauzgd

铁虫 (初入文坛)

大家帮忙看看,会不会是转化的问题啊。。。谢谢
4楼2014-10-07 14:16:01
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