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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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tinychan

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr 重复不出来 已有1人参与

构建载体要添加酶切位点,设计了引物(前面序列为添加酶切位点序列),以整个ORF的T载体为模板进行PCR扩增。
Primer F:5’-ggaattccatATGAAGGCCCGCTTAACGCA-3’ (Tm=65.4)
Primer R:5’-ccggaattCCTAGAACCAAGAAGACACTGAATA-3’ (Tm=64.11)
第一次以BIOTAKE的2XPower Taq PCR MasterMix 做了个退火温度梯度(58-68℃),结果每个温度都可以P出来,亮度还差不多,片段大小一致,没有非特异性;
想着要测序,然后我换了TAKARA的LA Taq 做了一下,几次结果都没出来,这是什么原因呢?
换了Ex TAQ 做了一次,结果可以出来,但却有非特异性扩增,为什么呢?
新手求各位大神指教!!!
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wangranjun

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广庭之惘然

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【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-10-22 12:26:16
不同的酶的最适条件不一样的,所以更换酶的话最好重新做一下温度梯度。
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
2楼2014-10-21 17:55:00
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