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tinychan

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr 重复不出来 已有1人参与

构建载体要添加酶切位点，设计了引物(前面序列为添加酶切位点序列），以整个ORF的T载体为模板进行PCR扩增。
Primer F：5’-ggaattccatATGAAGGCCCGCTTAACGCA-3’ (Tm=65.4)
Primer R：5’-ccggaattCCTAGAACCAAGAAGACACTGAATA-3’ (Tm=64.11)
第一次以BIOTAKE的2XPower Taq PCR MasterMix 做了个退火温度梯度（58-68℃），结果每个温度都可以P出来，亮度还差不多，片段大小一致，没有非特异性；
想着要测序，然后我换了TAKARA的LA Taq 做了一下，几次结果都没出来，这是什么原因呢？
换了Ex TAQ 做了一次，结果可以出来，但却有非特异性扩增，为什么呢？
新手求各位大神指教！！！
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1楼 2014-10-20 17:27:00
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-10-22 12:26:16
不同的酶的最适条件不一样的，所以更换酶的话最好重新做一下温度梯度。
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
2楼2014-10-21 17:55:00
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