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313cr

新虫 (初入文坛)

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[求助] 高GC含量基因PCR扩增不出条带已有9人参与

各位大神们，求助啊，最近在扩一个基因，GC含量含量为55.8%，不过5‘端GC含量太高了，引物不好设计，已经设计了好几对引物都没扩出来，有没有大神能给指点指点啊，基因序列：ATGGCGTCCAACGCCGCGGCTGCGGCGGCGGTGTCCCTGGACCAGGCCGTGGCGGCGTCGGCGGCGTTCTCGTCGCGGAAGCAGCTGCGGCTGCCCGCCGCGGCGCGCGGGGGGATGCGGGTGCGGGTGCGGGCGCGGGGGCGGCGGGAGGCGGTGGTGGTGGCGTCCGCGTCGTCGTCGTCGGTGGCAGCGCCGGCGGCGAAGGCGGAGGAGATCGTGCTCCAGCCCATCAGGGAGATCTCCGGGGCGGTTCAGCTGCCAGGGTCCAAGTCGCTCTCCAACAGGATCCTCCTCCTCTCCGCCCTCTCCGAGGGCACAACAGTGGTGGACAACTTGCTGAACAGTGAGGATGTTCACTACATGCTTGAGGCCCTGAAAGCCCTCGGGCTCTCTGTGGAAGCAGATAAAGTTGCAAAAAGAGCTGTAGTCGTTGGCTGTGGTGGCAAGTTTCCTGTTGAGAAGGATGCGAAAGAGGAAGTGCAACTCTTCTTGGGGAACGCTGGAACTGCAATGCGACCATTGACAGCAGCCGTGACTGCTGCTGGTGGAAATGCAACTTATGTGCTTGATGGAGTGCCACGAATGAGGGAGAGACCGATTGGTGACTTGGTTGTCGGGTTGAAACAACTTGGTGCGGATGTCGACTGTTTCCTTGGCACTGAATGCCCACCTGTTCGTGTCAAGGGAATTGGAGGACTTCCTGGTGGCAAGGTTAAGCTCTCTGGTTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCTGATGGCTGCTCCTTTGGCCCTTGGGGATGTGGAGATCGAAATCATTGACAAACTAATCTCCATTCCTTACGTTGAAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGTGAAGGCAGAGCATTCTGATAGTTGGGACAGATTCTATATTAAGGGAGGGCAGAAGTACAAATCTCCTGGAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGCGAGCTATTTCTTGGCTGGTGCTGCAATCACTGGAGGCACTGTGACAGTTCAAGGTTGTGGTACGACCAGTTTGCAGGGTGATGTCAAATTTGCTGAGGTACTTGAGATGATGGGAGCAAAGGTTACATGGACTGACACCAGTGTAACCGTAACTGGTCCACCACGTGAGCCTTATGGGAAGAAACACCTGAAAGCTGTTGATGTCAACATGAACAAAATGCCTGATGTTGCCATGACCCTTGCCGTTGTTGCACTCTTCGCTGATGGTCCAACTGCTATCAGAGATGTGGCTTCCTGGAGAGTAAAGGAAACCGAAAGGATGGTTGCAATTCGGACCGAGCTAACAAAGCTGGGAGCATCGGTTGAAGAAGGTCCTGACTACTGCATCATCACCCCACCGGAGAAGCTGAACATCACGGCAATCGACACCTACGATGATCACAGGATGGCCATGGCCTTCTCCCTCGCTGCCTGCGCCGACGTGCCCGTGACGATCAGGGACCCTGGTTGCACCCGCAAGACCTTCCCCAACTACTTCGACGTTCTAAGCACTTTCGTCAGGAACTGA
我是想要扩基因的全长，酶用过宝生物的LA Taq、rTaq酶、HOT star等，都没扩出来，中间有一次用KOD酶扩出来条带过，不过特异性不好，而且第二次一样的条件再扩就又扩不出来了，cDNA是用内参检测过了，别的同学扩其他基因也能扩出来，cDNA应该没问题，实在是不知道怎么弄了。

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1楼2014-10-11 14:34:37

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【答案】应助回帖

★ ★
313cr(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-15 14:57:05

我通过你提供的序列帮你设计了3对引物，建议你使用GenStar的普通mix先摸索下PCR条件，然后用pfu类得高保真Taq扩增你要的片段F1:GGCGGTGTCCCTGGACCA,R1:TGATCGTCACGGGCACG F2:TGATCGTCACGGGCACG, R2:TCGGCGGCGTTCTCGTC
F3: TCGGCGGCGTTCTCGTC, R3：TGCGGGTGCAACCAGGG，还有建议你使用RACE技术扩增出5‘UTR和3’UTR后在UTR区设计引物。祝你成功。