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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组菌质粒提取失败
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永峰1230

铜虫 (小有名气)

[求助] 重组菌质粒提取失败 已有6人参与

目的基因和pet28α 连接后 涂布 挑单菌落。  单菌落 LB培养--TB培养，提取质粒，但是提取不出来质粒。　　　　培养基中都加有抗生

质粒是用生工试剂盒提取，，已证明试剂盒没有问题。　　请问，提取不出来质粒是什么原因呢？？
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12
1楼 2014-09-11 08:55:42
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
永峰1230: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-09-11 19:01:02
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-12 10:49:59
实验室里很多杂菌都是有对卡纳的耐受性的，LZ的问题应该出现在感受态细胞本身或者转化过程中染了杂菌。
1.建议以后做转化的时候各种对照一定要做好。
2.倒平板的时候抗生素最好还是提前加到琼脂里。
3.抗生素的量一定要加足。转化的时候操作也要注意，如果配的CaCl2已经用了很多次，最好重新配置灭菌

对于你现在平板上的那批转化子，尽量多挑转化子做菌落PCR看是否有基因是可行的方案，但是假阳性也是可能的，就算扩出条带也不一定有质粒，还是重新做一次比较可靠。
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大家相互帮助哈
9楼2014-09-11 18:16:27
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永峰1230

铜虫 (小有名气)
ｋａｎａ　加的是１００微克每毫升，，
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12
2楼2014-09-11 09:11:20
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-12 18:31:30
永峰1230: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-10-15 11:02:49
1、检查自己的操作方法是否有误，例如最后一步是否把液体加到膜的正中间、或者忘了空离等
2、或许是你抽的浓度很低，上样量太小所以检测不到条带
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
3楼2014-09-11 09:19:50
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13227213581

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
永峰1230(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-12 10:49:34
永峰1230: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-10-15 11:02:57
引用回帖:
2楼: Originally posted by 永峰1230 at 2014-09-11 09:11:20
ｋａｎａ　加的是１００微克每毫升，，

加溶液2破菌的时候，是否破完全，溶液是否变澄清
加溶液3沉淀蛋白的时候，是否出现明显的固液分离，下沉澄清溶液是否能看得出来盐浓度很高的状态


还有可能是抽出的质粒浓度太低，没检测到，挂柱的时候速度低一点，多挂几次
elution液先加热到50-65℃，分多次洗脱，加elution液离心前先放一分钟


祝实验愉快
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justbesunshine
4楼2014-09-11 09:25:11
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