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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 酵母基因组提取问题
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)

[求助] 酵母基因组提取问题

各位大神，本人核酸提取新手一枚，依据分子克隆上酵母基因组微量提取的方法并稍加改进抽提念珠菌基因组，现抽提的基因组无RNA污染，无降解，就是有点不知道是蛋白质还是多糖之类的杂质，求大神指点，去除杂质的方法，抽提步骤如下
（1）        取1ml过夜培养菌液，离心收集菌体，菌体用1mL PBS洗涤2次，最大转速离心1min收集菌体；
（2）        加入500μL山梨醇缓冲液重悬菌体，混匀后加入50U Lyticase，37℃分别水浴4h；
（3）        12000rpm离心1min，收集沉淀；
（4）        沉淀中加入500μL酵母缓冲液重悬混匀，加入50μL 10%SDS，迅速混匀后置于65℃水浴30min；
（5）        加入200μL 5M KAc（pH8.9），混匀后冰浴1h；
（6）        12000rpm,4℃离心5min，转移上清于新的EP管中；
（7）        加入等体积的异丙醇，12000rpm离心10s；
（8）        弃上清，沉淀自然干燥10min；
（9）        沉淀加入300μL TE（含RNase）缓冲液溶解，37℃水浴消化RNA 1h；
（10）加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，充分混匀后12000rpm离心5min；
（11）取上层水相于新的EP管中，加入1/10体积的3M NaAc，等体积的异丙醇，混匀后12000rpm离心1min；
（12）加入500μL 75%乙醇洗涤DNA，12000rpm离心1min；
（13）弃上清，沉淀于室温自然干燥；然后加入50μL TE缓冲液溶解；
（14）取出5μL用于1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余溶液于-20℃中保存备用。

酵母基因组提取问题
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1楼2014-09-07 10:55:42
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小马奔腾0217

铜虫 (初入文坛)
你好  我想问一下PBS缓冲液和山梨醇缓冲液是怎么配制的？网上百度的都说法不一
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2楼2015-06-15 11:49:25
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小马奔腾0217 at 2015-06-15 11:49:25
你好  我想问一下PBS缓冲液和山梨醇缓冲液是怎么配制的？网上百度的都说法不一

根据分子克隆上的配方配。网上都是不同实验室自行改进的配方。如果初用，建议查看分子克隆
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3楼2016-03-07 13:39:17
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香蕉芒果99

新虫 (小有名气)
再抽提一下。

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4楼2016-03-07 15:49:46
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 香蕉芒果99 at 2016-03-07 15:49:46
再抽提一下。

我的问题已解决，谢谢。我是手工抽用来做三代测序的。基因组要求比较高。

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5楼2016-03-07 16:03:24
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