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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 手提基因组方法遇到的问题
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雪湛蓝

金虫 (正式写手)

[求助] 手提基因组方法遇到的问题

自今年三月份开学以来，我用酚氯仿法手提一个细菌的基因组，在提的过程中，首先加入溶菌酶，带菌体溶解后加入了10%的SDS，然后加入等体积氯仿和等体积的苯酚，离心后发现溶液分层，上下层透明，中间为白色蛋白质，然而，当我吸取上层液体时发现，上层不是水状液体，而是果冻状透明体，之后无论怎么吸都无可避免的会将白色蛋白质吸上去，以至于后期处理无法进行，得不到想要的基因组。但是上学期，我用此方法提取该菌的基因组时，相当顺利，也没有果冻状液体出现。有时认为是周围环境温度的问题，但是在冰上做也是得不到理想结果。所以在此求助大家，希望能得到解决办法，或者大家能提供一个细菌基因组提取的方法。
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脚踏实地追求科学真理！
1楼2012-06-06 12:01:51
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hsuley

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yqbter: 金币+2, 应助指数+1, 不错的回答！ 2012-06-07 08:10:07
silicare: BioEPI+1 2012-06-08 08:41:54
雪湛蓝: 金币+2, ★有帮助 2012-06-08 15:05:20
有几点
1. SDS浓度是不是太高了？10%是母液浓度还是终浓度？一般终浓度1%就可以了。
2. SDS低温下溶解度会下降的，所以建议控温在20度左右裂解，而不是在冰上。
3. 有时候我在提取基因组的时候也会发现低温离心后会在界面出现一些白色膜状物，有时候不一定是蛋白质，也可能是水相中低温析出的溶解的酚，在加入乙醇或异丙醇后会溶解（蛋白不会溶解），不影响后续纯化。
4. DNA样品浓度大时本身就是粘度很大的，不用担心，接着做就是了
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3楼2012-06-06 21:26:57
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diershimu

金虫 (小有名气)
楼主你好，我最近在提细菌的基因组，也遇见了和楼主一样的情况，不知道楼主是如何解决的呀，能否告诉一下我呀？不胜感激！
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8楼2013-03-02 17:14:56
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冰冰逛论坛

新虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
qinhy: 应助指数-1 2012-06-06 15:07:12
岁月悠悠，织出我们真诚的友谊，寒窗几载，谱出我们欢乐的乐章。
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2楼2012-06-06 12:44:36
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雪湛蓝

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hsuley at 2012-06-06 21:26:57
有几点
1. SDS浓度是不是太高了？10%是母液浓度还是终浓度？一般终浓度1%就可以了。
2. SDS低温下溶解度会下降的，所以建议控温在20度左右裂解，而不是在冰上。
3. 有时候我在提取基因组的时候也会发现低温离心后 ...

我加入乙醇后胶状物质并不溶解；即便是DNA样品的浓度真的很大，但是无法用水溶解，就影响到我后续的PCR，并且提取后的电泳结果显示DNA浓度很少，几乎没有。
SDS的终浓度为1%。
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脚踏实地追求科学真理！
4楼2012-06-07 11:49:39
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hsuley

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

也有可能是溶菌酶buffer的问题，可以重新配一下溶菌酶，除了钠盐，其他什么离子都不要带进去。
还有要在室温下加SDS，不要在冰上，甚至可以煮一下，然后再用酚抽提，可以提高提取效率
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5楼2012-06-07 18:22:47
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雪湛蓝

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hsuley at 2012-06-07 18:22:47
也有可能是溶菌酶buffer的问题，可以重新配一下溶菌酶，除了钠盐，其他什么离子都不要带进去。
还有要在室温下加SDS，不要在冰上，甚至可以煮一下，然后再用酚抽提，可以提高提取效率

煮SDS还是加过SDS的样品？另外我们是直接加入极少量的溶菌酶粉末的，没有配成溶液。
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脚踏实地追求科学真理！
6楼2012-06-08 09:01:11
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雪湛蓝

金虫 (正式写手)
最近做了一次不加SDS的基因组提取，电泳结果发现效果很好，所以，在手提基因组时不加SDS会更好。不知道有没有做过类似实验的虫友，帮忙解释一下在手提基因组中SDS的作用？
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脚踏实地追求科学真理！
7楼2012-06-08 14:58:37
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雪湛蓝

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by diershimu at 2013-03-02 17:14:56
楼主你好，我最近在提细菌的基因组，也遇见了和楼主一样的情况，不知道楼主是如何解决的呀，能否告诉一下我呀？不胜感激！

如果是也用这个方法的话，建议还加入SDS，把用溶菌酶溶解细菌这一步的温度和时间修改一下，我做了一下尝试：50 ℃，1-2 h。温度方面只要能保证溶菌酶不失活就行。
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脚踏实地追求科学真理！
9楼2013-03-03 11:47:25
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diershimu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主你好，首先非常感谢你能在百忙之中抽出时间看我的问题并耐心的给我回复，我真的非常感谢你，看完回复后我发现我的步骤没有加入溶菌酶，为了更清楚的说明，我把整个步骤贴在了下面，里面只有用SDS及酚氯仿，我真诚的希望楼主根据我的步骤再给我提出指导性的意见，我也没什么可以说的了，只有心中无限的感激之情或许能传递给楼主了，再次谢谢!
步骤：(1) 按 1%的接种量接种 Tx1 到装有 5ml LB 培养基的试管中，30℃150rpm振荡培养过夜，使其长至对数期。次日取 1ml 菌液于 1.5ml 离心管，10,000×g离心 1min 沉淀菌液。
(2) 弃上清，加 1ml 0.9% NaCl 将沉淀重悬浮，10,000×g 离心 3min。
(3) 弃上清，加 450μL TE 缓冲液（12 mM Tris-HCl，12mM EDTA， pH8.0）重悬浮，加 50μL 20% SDS，轻轻的上下颠倒离心管使之混匀，75℃水浴 5min(直至菌液裂解变为澄清)。
(4) 加 500μL 3:1 的酚：氯仿抽提蛋白质，轻轻上下颠倒使之混匀，10,000×g离心 5min。
(5) 轻轻吸取上清于一新的 1.5ml 离心管(注意不要吸到中间的蛋白质) 并补足体积到 500μL，加 500μL 3:1 的酚:氯仿，10,000×g 离心 5 分钟。吸上清，如此反复，直至看不到中间的蛋白质层为止(注意尽量防止 DNA 在抽提中发生断裂降解)。
(6) 吸取上清于一新的 1.5ml 离心管并补足体积到 500μL，加 500μL 氯仿，轻轻混匀，10,000×g 离心 5min。
(7) 吸取上清于一新的 1.5ml 离心管，加 1/10 体积 3M NaAc，然后加等体积的异丙醇，上下颠倒几次，此时应看到有絮状沉淀产生，10,000×g 离心 5min。
(8) 将上清吸出，加 1ml 70%的乙醇清洗沉淀，10,000×g 离心 5min，去上清，室温干燥。
(9) 加 50μL TE 缓冲液溶解沉淀，取 2μL电泳检测 DNA 质量及浓度。
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10楼2013-03-04 23:00:00
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