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漂流瓶1991

新虫 (小有名气)

[求助] 融合PCR求经验指点 已有7人参与

在做融合PCR,要将三个片段连接后一块全长PCR,这三个片段分别是1638bp,1565bp和317bp的,其中317bp要连在俩长片段中间。现在我已经分别将三片段做了PCR,并且胶回收了,也做了检测;之前由于小片段回收总出问题,所以胶回收后小片段电泳检测和长片段不在一块。下面分别是长片段和短片段电泳检测图,其中2-4号管都是1638bp的(因为回收时分了3管回收),5-6是1565bp的,点样时Marker用了2ul,样品都是用了6ul;小片段点样时Marker2ul,样品8ul;由于是第一次做不知道做全长PCR时三者的比例改以多少为宜,求高手,长辈指点一二,非常感谢!

融合PCR求经验指点
UVP00853Aug102014_副本2.jpg


融合PCR求经验指点-1
UVP00891Aug152014_副本.jpg
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漂流瓶1991

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by nl2016 at 2014-08-17 13:52:01
回收3个片段后,分别测定3个片段的浓度,等量混合后做PCR就好了!

对的,就是要测定三者的浓度,但我是研一新生提前进入实验室,不知道怎么测定所获片段浓度,求指点!我本来想根据跑胶条带分别和Marker亮度作比较,然后根据比例添加,可是感觉我自己认定的比例不怎么合理。
6楼2014-08-17 15:08:55
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查看全部 17 个回答

漂流瓶1991

新虫 (小有名气)

第二张图片1和2号管都是317bp的电泳条带
2楼2014-08-17 11:04:30
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nl2016

铁虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
回收3个片段后,分别测定3个片段的浓度,等量混合后做PCR就好了!
3楼2014-08-17 13:52:01
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
每一个大约几十ng就好了
4楼2014-08-17 14:59:02
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