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漂流瓶1991

新虫 (小有名气)

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[求助] 融合PCR求经验指点已有7人参与

在做融合PCR，要将三个片段连接后一块全长PCR，这三个片段分别是1638bp，1565bp和317bp的，其中317bp要连在俩长片段中间。现在我已经分别将三片段做了PCR，并且胶回收了，也做了检测；之前由于小片段回收总出问题，所以胶回收后小片段电泳检测和长片段不在一块。下面分别是长片段和短片段电泳检测图，其中2-4号管都是1638bp的（因为回收时分了3管回收），5-6是1565bp的，点样时Marker用了2ul，样品都是用了6ul；小片段点样时Marker2ul，样品8ul；由于是第一次做不知道做全长PCR时三者的比例改以多少为宜，求高手，长辈指点一二，非常感谢！

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1楼 2014-08-17 11:03:12

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

shuihaizi

金虫 (小有名气)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:36:40
gyesang: 回帖置顶 2014-08-18 15:09:12

你可以这样试试：
1，50ulPCR回收后，1ul的上样量类似于你第一张图的泳道5
2，融合PCR时，50ul反应体系各加1ul
3，小片段因为比较短，加1ul也是可以的（按照等mol来算，有点多），也可适当减少点，为了做起来方便1ul也是可以的，先试试
4，如果三个片段长度都差不多，比较容易；所以，如果3个放一起，一次不能融合，最好，两端先融合，再第三段融合，模板用量都差不多