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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 测序后发现碱基不一样了
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chenyanzhen

铁虫 (小有名气)

[求助] 测序后发现碱基不一样了 已有5人参与

构建质粒成功后去生工测序，测序结果中CCTCAGTGAGATTGTAGTGCTTGCTTAACAATGGGTTTTGGCTGCAAGTGCAATAATTCTTGCTTTGTGTGCCAGTTTTTATGTGGACATTTGATTACCTTTGCAC
变成了CCTCAGTGAGATTGTAGTGCTTGCTTAACAATGGGTTTTGGCTGCAAGTGCAATAATTCTTGCTTTGTGTGCCCGTTTTTATGTGGACATTTGATTACCTTTGCAC.在nvbi中对这两条序列进行BLAST，发现英文名称不一样，我要的是塔玛亚历山大藻四型，出现这种结果该怎么办啊？
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活在当下，充实自己
1楼 2014-08-15 17:06:56
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

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★ ★
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chenyanzhen(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-16 12:49:45
一个点突变可以用融合PCR的方式将这个点重新突变回来……或者选择重新PCR。不同细胞中突变体的类型可能会有区别的，正常情况！祝顺利！
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
2楼2014-08-15 17:10:02
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ncuduhan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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chenyanzhen(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-16 12:49:53
有一个点突变很正常，如果是同义突变你觉得不影响就继续下去吧，如果你觉得不行的话，就重新PCR吧~没有办法！祝你顺利！
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3楼2014-08-15 20:07:18
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

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★
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chenyanzhen(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-19 20:38:46
测序是允许错误的，一般都有一点点错误率的哦，这个很正常的。你去生工测序，一般都是很多很多个单一起跑一个半导体芯片（二代测序），这个错误肯定不能避免的，一般不会给你再做一次毛细管电泳的。本来就便宜，做了不亏本哇。大家都这样过来的。一个碱基而已哇。
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4楼2014-08-16 22:48:32
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落叶的轨迹

金虫 (初入文坛)

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我的测序结果在中间位置丢失了3个碱基，还是连着的，重新pcr重新测序结果也还是一样，愁

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5楼2014-08-16 23:54:30
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BioChen

银虫 (正式写手)

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★
chenyanzhen(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-19 20:39:00
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4楼: Originally posted by snoopytbw at 2014-08-16 22:48:32
测序是允许错误的，一般都有一点点错误率的哦，这个很正常的。你去生工测序，一般都是很多很多个单一起跑一个半导体芯片（二代测序），这个错误肯定不能避免的，一般不会给你再做一次毛细管电泳的。本来就便宜，做了 ...

构建质粒测序，走的是一代测序，也就是毛细管电泳，20多块钱野葛反应。建议楼主查看一下图谱，也就是ab1这个文件，看看是不是真的突变了，还是测序质量不高。
NCBI的序列是refseq，也就是说是参考序列，不一定要一模一样的。
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6楼2014-08-18 18:15:49
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chenyanzhen

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by BioChen at 2014-08-18 18:15:49
构建质粒测序，走的是一代测序，也就是毛细管电泳，20多块钱野葛反应。建议楼主查看一下图谱，也就是ab1这个文件，看看是不是真的突变了，还是测序质量不高。
NCBI的序列是refseq，也就是说是参考序列，不一定要一 ...

恩，明白了。谢谢
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活在当下，充实自己
7楼2014-08-18 18:29:23
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

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★
chenyanzhen(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-19 20:39:11
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6楼: Originally posted by BioChen at 2014-08-18 18:15:49
构建质粒测序，走的是一代测序，也就是毛细管电泳，20多块钱野葛反应。建议楼主查看一下图谱，也就是ab1这个文件，看看是不是真的突变了，还是测序质量不高。
NCBI的序列是refseq，也就是说是参考序列，不一定要一 ...

你说的不准确，如果是公司自己构建会用一代，如果是自己构建送过去，公司除非问你有什么要求，如果不提都是二代的。而且不是外包做测序也会先用二代测下再用一代补一遍。多年送检都这么干的。

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8楼2014-08-19 06:49:50
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
chenyanzhen(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-19 20:39:23
引用回帖:
8楼: Originally posted by snoopytbw at 2014-08-19 06:49:50
你说的不准确，如果是公司自己构建会用一代，如果是自己构建送过去，公司除非问你有什么要求，如果不提都是二代的。而且不是外包做测序也会先用二代测下再用一代补一遍。多年送检都这么干的。
...

你送检什么样品？
二代测序通量太高，做这种质粒测序，我还没有听二代测序有成本优势的。我们曾经评估过MiSeq做一代测序样品的测序成本，远高于现有的一代测序。
二代测序结果，用一代测序验证，这个很常见。但是能用一代测序解决的，先用二代测序做，还请你具体讲一下。
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9楼2014-08-19 19:34:42
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