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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 新人求助：DGGE电泳问题，条带不够清晰
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小甜点fly

铁虫 (初入文坛)

[求助] 新人求助：DGGE电泳问题，条带不够清晰 已有2人参与

新人做DGGE，求助~~~
DGGE电泳分析大肠菌群。提取粪便DNA，引物：GC-F338,R518，片段230bp，50μPCR体系：Mix25μ，引物1μ*2，DNA模板1μ（400ng）。PCR程序：94℃ 2min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，*30次循环；72℃ 2min。退火温度已经做过梯度，57和58度较好，但琼脂糖跑胶发现除230bp以外还有一50bp左右的杂带，应该是引物二聚体（温度梯度下引物二聚体的量并没有明显改变）。
10%胶浓度，40%-75%变性梯度（垂直电泳变性区域40%-70%），一般30或40μl上样，PCR产物：buffer=25：10。预电泳200V，20min-30min。电泳150V ，5h。
目前的主要问题:引物二聚体会不会影响DGGE效果？DGGE图有的条带都不是很清晰，不清晰分析也很成问题，正常应该是一条细细的条带，是PCR的问题还是胶有问题？还需要怎样优化？

新人求助：DGGE电泳问题，条带不够清晰
20140801 4样品.jpg
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1楼 2014-08-01 22:31:08
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小甜点fly

铁虫 (初入文坛)
有没有做过相关课题的前辈啊？
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2楼2014-08-01 22:45:18
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小甜点fly(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-03 19:04:25
说明菌丰度差距很大啊，有的已经很亮了，有的还是很淡的，考虑增加循环数到35试试，200V完了之后电压低点跑久点，你的条带还离点样孔很近，说不定还有没出来或者没分开的
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ControlMyself
3楼2014-08-03 10:38:00
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小甜点fly

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 爱睡猪 at 2014-08-03 10:38:00
说明菌丰度差距很大啊，有的已经很亮了，有的还是很淡的，考虑增加循环数到35试试，200V完了之后电压低点跑久点，你的条带还离点样孔很近，说不定还有没出来或者没分开的

恩恩，好的，非常感谢。以后确定条件了可以过夜跑，电压低效果应该会好些。还请问下引物二聚体对DGGE会不会有影响？
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4楼2014-08-04 09:22:28
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yuheng19831123

新虫 (初入文坛)
★
小甜点fly(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-20 20:10:45
变性剂范围可以缩小不啊   可以尝试低电压长时间  试试   


银染要清晰些吧
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5楼2014-08-20 19:15:43
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biolinker

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 小甜点fly at 2014-08-04 09:22:28
恩恩，好的，非常感谢。以后确定条件了可以过夜跑，电压低效果应该会好些。还请问下引物二聚体对DGGE会不会有影响？...

引物二聚体对后面跑DGGE胶是有影响的。
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6楼2014-08-21 13:16:58
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小甜点fly

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yuheng19831123 at 2014-08-20 19:15:43
变性剂范围可以缩小不啊   可以尝试低电压长时间  试试   


银染要清晰些吧

变形梯度的确定是之前做了一个垂直电泳，S型曲线，然后确定了变形梯度是40-70%，之后按照这个范围试了几次有35%-75%、35%-70%、40%-75%，发现40-75%的好些。垂直电泳做出来的不是很准确么？而且我觉得虽然确定了梯度但是每次做出来也都不太一样。
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7楼2014-08-23 14:16:50
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小甜点fly

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by biolinker at 2014-08-21 13:16:58
引物二聚体对后面跑DGGE胶是有影响的。...

好的，谢谢。目前现在通过优化PCR条件不能去除引物二聚体，请问您有什么建议么？引物是按照看过的文献里面选择合成的。
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8楼2014-08-23 14:19:10
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Shiong1314

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小甜点fly at 2014-08-23 14:16:50
变形梯度的确定是之前做了一个垂直电泳，S型曲线，然后确定了变形梯度是40-70%，之后按照这个范围试了几次有35%-75%、35%-70%、40%-75%，发现40-75%的好些。垂直电泳做出来的不是很准确么？而且我觉得虽然确定了梯 ...

LZ，我想问一下，我要配置35%-75%、35%-70%、40%-75%这些梯度的胶应该怎么配啊
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9楼2017-06-30 15:11:40
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