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小甜点fly

铁虫 (初入文坛)

[求助] 新人求助:DGGE电泳问题,条带不够清晰已有2人参与

新人做DGGE,求助~~~
DGGE电泳分析大肠菌群。提取粪便DNA,引物:GC-F338,R518,片段230bp,50μPCR体系:Mix25μ,引物1μ*2,DNA模板1μ(400ng)。PCR程序:94℃ 2min;94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 30s,*30次循环;72℃ 2min。退火温度已经做过梯度,57和58度较好,但琼脂糖跑胶发现除230bp以外还有一50bp左右的杂带,应该是引物二聚体(温度梯度下引物二聚体的量并没有明显改变)。
10%胶浓度,40%-75%变性梯度(垂直电泳变性区域40%-70%),一般30或40μl上样,PCR产物:buffer=25:10。预电泳200V,20min-30min。电泳150V ,5h。
目前的主要问题:引物二聚体会不会影响DGGE效果?DGGE图有的条带都不是很清晰,不清晰分析也很成问题,正常应该是一条细细的条带,是PCR的问题还是胶有问题?还需要怎样优化?

新人求助:DGGE电泳问题,条带不够清晰
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小甜点fly(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-03 19:04:25
说明菌丰度差距很大啊,有的已经很亮了,有的还是很淡的,考虑增加循环数到35试试,200V完了之后电压低点跑久点,你的条带还离点样孔很近,说不定还有没出来或者没分开的
ControlMyself
3楼2014-08-03 10:38:00
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小甜点fly

铁虫 (初入文坛)

有没有做过相关课题的前辈啊?
2楼2014-08-01 22:45:18
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小甜点fly

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 爱睡猪 at 2014-08-03 10:38:00
说明菌丰度差距很大啊,有的已经很亮了,有的还是很淡的,考虑增加循环数到35试试,200V完了之后电压低点跑久点,你的条带还离点样孔很近,说不定还有没出来或者没分开的

恩恩,好的,非常感谢。以后确定条件了可以过夜跑,电压低效果应该会好些。还请问下引物二聚体对DGGE会不会有影响?
4楼2014-08-04 09:22:28
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yuheng19831123

新虫 (初入文坛)


小甜点fly(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-20 20:10:45
变性剂范围可以缩小不啊   可以尝试低电压长时间  试试   


银染要清晰些吧
5楼2014-08-20 19:15:43
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