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小甜点fly

铁虫 (初入文坛)

[求助] 新人求助:DGGE电泳问题,条带不够清晰已有2人参与

新人做DGGE,求助~~~
DGGE电泳分析大肠菌群。提取粪便DNA,引物:GC-F338,R518,片段230bp,50μPCR体系:Mix25μ,引物1μ*2,DNA模板1μ(400ng)。PCR程序:94℃ 2min;94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 30s,*30次循环;72℃ 2min。退火温度已经做过梯度,57和58度较好,但琼脂糖跑胶发现除230bp以外还有一50bp左右的杂带,应该是引物二聚体(温度梯度下引物二聚体的量并没有明显改变)。
10%胶浓度,40%-75%变性梯度(垂直电泳变性区域40%-70%),一般30或40μl上样,PCR产物:buffer=25:10。预电泳200V,20min-30min。电泳150V ,5h。
目前的主要问题:引物二聚体会不会影响DGGE效果?DGGE图有的条带都不是很清晰,不清晰分析也很成问题,正常应该是一条细细的条带,是PCR的问题还是胶有问题?还需要怎样优化?

新人求助:DGGE电泳问题,条带不够清晰
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小甜点fly(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-03 19:04:25

小甜点fly

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yuheng19831123

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小甜点fly(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-20 20:10:45

biolinker

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