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小甜点fly

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 新人求助：DGGE电泳问题，条带不够清晰已有2人参与

新人做DGGE，求助~~~
DGGE电泳分析大肠菌群。提取粪便DNA，引物：GC-F338,R518，片段230bp，50μPCR体系：Mix25μ，引物1μ*2，DNA模板1μ（400ng）。PCR程序：94℃ 2min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，*30次循环；72℃ 2min。退火温度已经做过梯度，57和58度较好，但琼脂糖跑胶发现除230bp以外还有一50bp左右的杂带，应该是引物二聚体（温度梯度下引物二聚体的量并没有明显改变）。
10%胶浓度，40%-75%变性梯度（垂直电泳变性区域40%-70%），一般30或40μl上样，PCR产物：buffer=25：10。预电泳200V，20min-30min。电泳150V ，5h。
目前的主要问题:引物二聚体会不会影响DGGE效果？DGGE图有的条带都不是很清晰，不清晰分析也很成问题，正常应该是一条细细的条带，是PCR的问题还是胶有问题？还需要怎样优化？

20140801 4样品.jpg

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1楼 2014-08-01 22:31:08

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Shiong1314

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

7楼: Originally posted by 小甜点fly at 2014-08-23 14:16:50
变形梯度的确定是之前做了一个垂直电泳，S型曲线，然后确定了变形梯度是40-70%，之后按照这个范围试了几次有35%-75%、35%-70%、40%-75%，发现40-75%的好些。垂直电泳做出来的不是很准确么？而且我觉得虽然确定了梯 ...

LZ，我想问一下，我要配置35%-75%、35%-70%、40%-75%这些梯度的胶应该怎么配啊