| 查看: 2237 | 回复: 9 | ||
raohuihua新虫 (小有名气)
|
[求助]
粘性末端老是连接不上
|
|
小妹最近在做一个质粒与片段粘性末端连接，体系如下： 载体6055bp 3ul 片段1758bp 4ul 10xT4ligase buffer 1ul T4 ligase (Takara) 1ul PEG 4000 1ul.............................10ul，4°过夜，转化TOP10 片段是PCR扩增胶回收得到，载体和片段均用NcoI 酶切回收纯化，没有测浓度，但是有跑胶，亮度还行，载体是GN抗性的，片段是 tet 抗性，转化后我分别铺了tet 、tet+GN的板，都没有长，究竟是什么原因呢？附上我的电泳图，有哪位大侠能够指导一下？不甚感激。 后来又换了个体系，如下，还是没有连接成功 载体6055bp 2ul 片段1758bp 5ul 10xT4ligase buffer 1ul T4 ligase (Takara) 1ul ddH20 1ul................10ul  w27h2626338_1404100224_785.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有222人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 粘性末端连接时长问题
已经有27人回复
- 平端酶与粘性末端酶一起使用，产物能否与目标片段一起链接呢？
已经有12人回复
- 合成的引物直接退火形成粘性末端后连入载体
已经有13人回复
- BamHI,SmaI平末端粘性末端连接问题
已经有11人回复
- pMD19-T双酶切，目的片段上酶切位点和载体上一样
已经有7人回复
- 载体去磷酸化后大小变大
已经有3人回复
- 请问这个物质中Al和O是怎么连接的？
已经有4人回复
- PCR产物平末端化问题
已经有5人回复
- 目的基因连T载体能连上，双酶切后连不上HTB质粒，都三个月了，纠结啊。。。
已经有21人回复
- 克隆基因为什么一直连不到载体上
已经有11人回复
- 关于目的基因不同向连接到T载体上的问题
已经有19人回复
- 2.7Kb的片段连接问题
已经有6人回复
- 酶切后的补平连接
已经有9人回复
- 关于平末端连接
已经有14人回复
- 一个平末端和粘性末端怎样连接比较好
已经有8人回复
- 表达载体的链接
已经有16人回复
- 双酶切粘性末端连接不上
已经有21人回复
- 虚心请教关于平—粘末端的连接问题
已经有18人回复
- 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上
已经有26人回复
- DNA片段经过酶切后的粘性末端怎么磨平？
已经有15人回复
- PCR ， 双酶切，连接问题
已经有17人回复
- 【求助/交流】酶切后的粘性末端补平
已经有4人回复
- 【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办
已经有17人回复
- 【求助/交流】PCR产物连接请教！
已经有5人回复
2楼2014-07-10 00:53:32
raohuihua
新虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 510.3
- 散金: 30
- 帖子: 95
- 在线: 27小时
- 虫号: 2626338
- 注册: 2013-08-31
- 专业: 病原微生物变异与耐药
3楼2014-07-10 09:02:51
4楼2014-07-10 11:15:28
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
raohuihua: 金币+5, ★有帮助 2014-07-10 19:53:02
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:50:23
感谢参与，应助指数 +1
raohuihua: 金币+5, ★有帮助 2014-07-10 19:53:02
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:50:23
|
你这个设计有点坑，主要有以下2个原因： 1.载体自连，要去检测很容易，你铺一个GN抗性的平板，去转化一下就知道了，你就会知道这种单酶切的自连会有多严重，载体你可以做一个去磷酸化 2.你确定你PCR的时候加入了保护碱基？另外就算是你成功连接进去了，你去筛选还得筛方向。 相关建议： 1.载体总量放的少一些，相反的片段量多一些，这样会增加碰撞几率，有可能会连上。 2.至于你说的Tet和Tet-GN都不长，我想问一下，你的片段难道就是Tet抗性？你确定你做进去的这一段正确表达出Tet抗性？如果确定那没问题，如果不确定就会比较麻烦。 其他的你想知道的可以私信我 |
5楼2014-07-10 11:28:06
raohuihua
新虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 510.3
- 散金: 30
- 帖子: 95
- 在线: 27小时
- 虫号: 2626338
- 注册: 2013-08-31
- 专业: 病原微生物变异与耐药
6楼2014-07-10 19:30:38
7楼2014-07-10 19:42:12
raohuihua
新虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 510.3
- 散金: 30
- 帖子: 95
- 在线: 27小时
- 虫号: 2626338
- 注册: 2013-08-31
- 专业: 病原微生物变异与耐药
|
谢谢你的建议，TET的抗性片段是我从pEX18Tc上扩下来的，之前我师姐就是用这个片段与pJN105连接成功了，其实最开始我是想直接用我师姐构建好的这个质粒（pJN105-TET）与另外一个片段连接的，连接了两次没连接上，我就试着用酶切鉴定了pJN105-TET，发现在正确的条带之外还出现了另外不需要的条带，所以我决定自己再构建一次pJN105-TET,然后就出现了上述的情况。我现在又开始用我师姐的质粒与我自己的片段做连接了，发现在扩增片段的时候老是有非特异性条带，之前用相同的体系模板都不会，然后就用胶回收，又连接了几次，在GN的平板上长了好多，而TET的平板上都不长，很奇怪，按理说我用的双酶切，载体不会环化，如果万一环化了，它同时有GN和TET抗性，不可能GN上长，TET 上不长啊？我都纳闷死了 |
8楼2014-07-10 19:49:01
raohuihua
新虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 510.3
- 散金: 30
- 帖子: 95
- 在线: 27小时
- 虫号: 2626338
- 注册: 2013-08-31
- 专业: 病原微生物变异与耐药
9楼2014-07-10 20:02:50
raohuihua
新虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 510.3
- 散金: 30
- 帖子: 95
- 在线: 27小时
- 虫号: 2626338
- 注册: 2013-08-31
- 专业: 病原微生物变异与耐药
其实还在求助当中啦。。。。。还需要各位大侠指点啊
10楼2014-07-10 20:10:36
