24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

raohuihua

新虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 510.3
散金: 30
帖子: 95
在线: 27小时
虫号: 2626338
注册: 2013-08-31
专业: 病原微生物变异与耐药

[求助] 粘性末端老是连接不上

小妹最近在做一个质粒与片段粘性末端连接，体系如下：
载体6055bp       3ul
片段1758bp       4ul
10xT4ligase buffer 1ul
T4 ligase (Takara) 1ul
PEG 4000             1ul.............................10ul，4°过夜，转化TOP10
片段是PCR扩增胶回收得到，载体和片段均用NcoI 酶切回收纯化，没有测浓度，但是有跑胶，亮度还行，载体是GN抗性的，片段是 tet 抗性，转化后我分别铺了tet 、tet+GN的板，都没有长，究竟是什么原因呢？附上我的电泳图，有哪位大侠能够指导一下？不甚感激。
后来又换了个体系，如下，还是没有连接成功
载体6055bp       2ul
片段1758bp       5ul
10xT4ligase buffer 1ul
T4 ligase (Takara) 1ul
ddH20                1ul................10ul

w27h2626338_1404100224_785.jpg

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

粘性末端连接时长问题已经有27人回复
平端酶与粘性末端酶一起使用，产物能否与目标片段一起链接呢？已经有12人回复
合成的引物直接退火形成粘性末端后连入载体已经有13人回复
BamHI,SmaI平末端粘性末端连接问题已经有11人回复
pMD19-T双酶切，目的片段上酶切位点和载体上一样已经有7人回复
载体去磷酸化后大小变大已经有3人回复
请问这个物质中Al和O是怎么连接的？已经有4人回复
PCR产物平末端化问题已经有5人回复
目的基因连T载体能连上，双酶切后连不上HTB质粒，都三个月了，纠结啊。。。已经有21人回复
克隆基因为什么一直连不到载体上已经有11人回复
关于目的基因不同向连接到T载体上的问题已经有19人回复
2.7Kb的片段连接问题已经有6人回复
酶切后的补平连接已经有9人回复
关于平末端连接已经有14人回复
一个平末端和粘性末端怎样连接比较好已经有8人回复
表达载体的链接已经有16人回复
双酶切粘性末端连接不上已经有21人回复
虚心请教关于平—粘末端的连接问题已经有18人回复
高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上已经有26人回复
DNA片段经过酶切后的粘性末端怎么磨平？已经有15人回复
PCR ，双酶切，连接问题已经有17人回复
【求助/交流】酶切后的粘性末端补平已经有4人回复
【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办已经有17人回复
【求助/交流】PCR产物连接请教！已经有5人回复

1楼 2014-07-09 21:41:14

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

raohuihua

新虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 510.3
散金: 30
帖子: 95
在线: 27小时
虫号: 2626338
注册: 2013-08-31
专业: 病原微生物变异与耐药

引用回帖:

5楼: Originally posted by 393658000 at 2014-07-10 11:28:06
你这个设计有点坑，主要有以下2个原因：
1.载体自连，要去检测很容易，你铺一个GN抗性的平板，去转化一下就知道了，你就会知道这种单酶切的自连会有多严重，载体你可以做一个去磷酸化
2.你确定你PCR的时候加入了保 ...

谢谢你的建议，TET的抗性片段是我从pEX18Tc上扩下来的，之前我师姐就是用这个片段与pJN105连接成功了，其实最开始我是想直接用我师姐构建好的这个质粒（pJN105-TET）与另外一个片段连接的，连接了两次没连接上，我就试着用酶切鉴定了pJN105-TET，发现在正确的条带之外还出现了另外不需要的条带，所以我决定自己再构建一次pJN105-TET,然后就出现了上述的情况。我现在又开始用我师姐的质粒与我自己的片段做连接了，发现在扩增片段的时候老是有非特异性条带，之前用相同的体系模板都不会，然后就用胶回收，又连接了几次，在GN的平板上长了好多，而TET的平板上都不长，很奇怪，按理说我用的双酶切，载体不会环化，如果万一环化了，它同时有GN和TET抗性，不可能GN上长，TET 上不长啊？我都纳闷死了