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raohuihua新虫 (小有名气)
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粘性末端老是连接不上
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小妹最近在做一个质粒与片段粘性末端连接，体系如下： 载体6055bp 3ul 片段1758bp 4ul 10xT4ligase buffer 1ul T4 ligase (Takara) 1ul PEG 4000 1ul.............................10ul，4°过夜，转化TOP10 片段是PCR扩增胶回收得到，载体和片段均用NcoI 酶切回收纯化，没有测浓度，但是有跑胶，亮度还行，载体是GN抗性的，片段是 tet 抗性，转化后我分别铺了tet 、tet+GN的板，都没有长，究竟是什么原因呢？附上我的电泳图，有哪位大侠能够指导一下？不甚感激。 后来又换了个体系，如下，还是没有连接成功 载体6055bp 2ul 片段1758bp 5ul 10xT4ligase buffer 1ul T4 ligase (Takara) 1ul ddH20 1ul................10ul  w27h2626338_1404100224_785.jpg |
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2楼2014-07-10 00:53:32
raohuihua
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3楼2014-07-10 09:02:51
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你这个设计有点坑，主要有以下2个原因： 1.载体自连，要去检测很容易，你铺一个GN抗性的平板，去转化一下就知道了，你就会知道这种单酶切的自连会有多严重，载体你可以做一个去磷酸化 2.你确定你PCR的时候加入了保护碱基？另外就算是你成功连接进去了，你去筛选还得筛方向。 相关建议： 1.载体总量放的少一些，相反的片段量多一些，这样会增加碰撞几率，有可能会连上。 2.至于你说的Tet和Tet-GN都不长，我想问一下，你的片段难道就是Tet抗性？你确定你做进去的这一段正确表达出Tet抗性？如果确定那没问题，如果不确定就会比较麻烦。 其他的你想知道的可以私信我 |
5楼2014-07-10 11:28:06
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谢谢你的建议，TET的抗性片段是我从pEX18Tc上扩下来的，之前我师姐就是用这个片段与pJN105连接成功了，其实最开始我是想直接用我师姐构建好的这个质粒（pJN105-TET）与另外一个片段连接的，连接了两次没连接上，我就试着用酶切鉴定了pJN105-TET，发现在正确的条带之外还出现了另外不需要的条带，所以我决定自己再构建一次pJN105-TET,然后就出现了上述的情况。我现在又开始用我师姐的质粒与我自己的片段做连接了，发现在扩增片段的时候老是有非特异性条带，之前用相同的体系模板都不会，然后就用胶回收，又连接了几次，在GN的平板上长了好多，而TET的平板上都不长，很奇怪，按理说我用的双酶切，载体不会环化，如果万一环化了，它同时有GN和TET抗性，不可能GN上长，TET 上不长啊？我都纳闷死了 |
8楼2014-07-10 19:49:01
raohuihua
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9楼2014-07-10 20:02:50
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其实还在求助当中啦。。。。。还需要各位大侠指点啊
10楼2014-07-10 20:10:36