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raohuihua新虫 (小有名气)
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粘性末端老是连接不上
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小妹最近在做一个质粒与片段粘性末端连接，体系如下： 载体6055bp 3ul 片段1758bp 4ul 10xT4ligase buffer 1ul T4 ligase (Takara) 1ul PEG 4000 1ul.............................10ul，4°过夜，转化TOP10 片段是PCR扩增胶回收得到，载体和片段均用NcoI 酶切回收纯化，没有测浓度，但是有跑胶，亮度还行，载体是GN抗性的，片段是 tet 抗性，转化后我分别铺了tet 、tet+GN的板，都没有长，究竟是什么原因呢？附上我的电泳图，有哪位大侠能够指导一下？不甚感激。 后来又换了个体系，如下，还是没有连接成功 载体6055bp 2ul 片段1758bp 5ul 10xT4ligase buffer 1ul T4 ligase (Takara) 1ul ddH20 1ul................10ul  w27h2626338_1404100224_785.jpg |
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raohuihua
新虫 (小有名气)
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3楼2014-07-10 09:02:51
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你这个设计有点坑，主要有以下2个原因： 1.载体自连，要去检测很容易，你铺一个GN抗性的平板，去转化一下就知道了，你就会知道这种单酶切的自连会有多严重，载体你可以做一个去磷酸化 2.你确定你PCR的时候加入了保护碱基？另外就算是你成功连接进去了，你去筛选还得筛方向。 相关建议： 1.载体总量放的少一些，相反的片段量多一些，这样会增加碰撞几率，有可能会连上。 2.至于你说的Tet和Tet-GN都不长，我想问一下，你的片段难道就是Tet抗性？你确定你做进去的这一段正确表达出Tet抗性？如果确定那没问题，如果不确定就会比较麻烦。 其他的你想知道的可以私信我 |
5楼2014-07-10 11:28:06
