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raohuihua

新虫 (小有名气)

[求助] 粘性末端老是连接不上

小妹最近在做一个质粒与片段粘性末端连接，体系如下：
载体6055bp          3ul
片段1758bp          4ul
10xT4ligase buffer 1ul
T4 ligase (Takara)   1ul
PEG 4000              1ul.............................10ul，4°过夜，转化TOP10
片段是PCR扩增胶回收得到，载体和片段均用NcoI 酶切回收纯化，没有测浓度，但是有跑胶，亮度还行，载体是GN抗性的，片段是 tet 抗性，转化后我分别铺了tet 、tet+GN的板，都没有长，究竟是什么原因呢？附上我的电泳图，有哪位大侠能够指导一下？不甚感激。
后来又换了个体系，如下，还是没有连接成功
载体6055bp          2ul
片段1758bp          5ul
10xT4ligase buffer 1ul
T4 ligase (Takara)   1ul
ddH20                   1ul................10ul

粘性末端老是连接不上
w27h2626338_1404100224_785.jpg
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1楼 2014-07-09 21:41:14
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raohuihua

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by phytoman at 2014-07-10 00:53:32
看看感受态的效率有没有问题，另外你做的是单酶切啊？

感受态是新做的，阴性阳性对照我都做过，都没问题；载体是单酶切的，片段扩增的上下游引物都含有相同的酶切位点，是不是单酶切效率不高?另外，我想问一下PCR后胶回收是不是会有影响啊？
赞一下 回复此楼
3楼2014-07-10 09:02:51
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phytoman

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-10 11:16:18
看看感受态的效率有没有问题，另外你做的是单酶切啊？
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2楼2014-07-10 00:53:32
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jamesfeng

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
raohuihua(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-11 11:08:45
温度太低了，不要加PEG4000,16度左右连接2h左右。转化的时候，多转点试试！
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4楼2014-07-10 11:15:28
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
raohuihua: 金币+5, ★有帮助 2014-07-10 19:53:02
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:50:23
你这个设计有点坑，主要有以下2个原因：
1.载体自连，要去检测很容易，你铺一个GN抗性的平板，去转化一下就知道了，你就会知道这种单酶切的自连会有多严重，载体你可以做一个去磷酸化
2.你确定你PCR的时候加入了保护碱基？另外就算是你成功连接进去了，你去筛选还得筛方向。
相关建议：
1.载体总量放的少一些，相反的片段量多一些，这样会增加碰撞几率，有可能会连上。
2.至于你说的Tet和Tet-GN都不长，我想问一下，你的片段难道就是Tet抗性？你确定你做进去的这一段正确表达出Tet抗性？如果确定那没问题，如果不确定就会比较麻烦。
其他的你想知道的可以私信我
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5楼2014-07-10 11:28:06
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